醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)人類基因組

關(guān)于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)人類基因組第1頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三概念以分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，以生物體內(nèi)全部基因?yàn)檠芯繉?duì)象，在全基因背景下和整體水平上探索生命活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律及其內(nèi)外環(huán)境影響機(jī)制的科學(xué)。第2頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三2001年2月中旬，《Nature》與《Science》分別發(fā)表了人類基因組工作框架圖,報(bào)告人類基因組共有30億個(gè)堿基對(duì),預(yù)測(cè)編碼基因31,000個(gè),比最初預(yù)測(cè)的10萬(wàn)個(gè)編碼基因數(shù)大大減少。2003年

人類基因組計(jì)劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)第3頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一節(jié)

人類基因組和基因組學(xué)第4頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

基因組(genome)是德國(guó)遺傳學(xué)家H.Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個(gè)詞縮合而創(chuàng)造的一個(gè)新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其含義擴(kuò)展為在個(gè)體水平代表一個(gè)個(gè)體所有遺傳性狀的總和，在細(xì)胞水平代表一個(gè)細(xì)胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平代表一個(gè)物種所有DNA分子的總和。

基因組學(xué)概念及范疇第5頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組(genome)泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。基因組學(xué)(genomics)就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能的科學(xué)。第6頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組學(xué)包括3個(gè)不同的亞領(lǐng)域結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)功能基因組學(xué)(functionalgenomics)比較基因組學(xué)(comparativegenomics)基因組學(xué)概念第7頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)是通過(guò)人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)的實(shí)施來(lái)完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測(cè)定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。第8頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二節(jié)

人類基因組計(jì)劃第9頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三人類基因組計(jì)劃HGP也稱人類基因測(cè)序計(jì)劃，主要目標(biāo)是完成對(duì)人的基因組的所有堿基序列的測(cè)定，闡明人體中全部基因的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)、調(diào)控方式及致病突變的全部信息。基本任務(wù)是完成遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。人類基因組包括24條染色體，3×109bp，3-4萬(wàn)個(gè)基因。第10頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三人類基因組計(jì)劃的目標(biāo)人類基因組計(jì)劃是一項(xiàng)國(guó)際性的研究計(jì)劃。它的目標(biāo)是通過(guò)以美國(guó)為主的全球性的國(guó)際合作，在大約15年的時(shí)間里完成人類24條染色體的基因組作圖和DNA全長(zhǎng)序列分析，進(jìn)行基因的鑒定和功能分析。人類基因組計(jì)劃的“科學(xué)產(chǎn)品”將是一個(gè)人類遺傳信息數(shù)據(jù)庫(kù)，將是一本指導(dǎo)人類進(jìn)化的“說(shuō)明書”。人類基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)就是確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，并確定、闡明和記錄組成的人類基因組的全部DNA序列。第11頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三人類基因組計(jì)劃的研究概況

1986年

美國(guó)病毒學(xué)家R·杜爾貝科（1914－）1986年3月7日在美國(guó)《科學(xué)》雜志上發(fā)表了一篇題為《癌癥研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn)——人類基因組的全序列分析》的文章，他指出：“人類DNA序列是人類的真諦，這個(gè)世界上發(fā)生的一切事情，都與這一序列息息相關(guān)。”該文后來(lái)被稱為“人類基因組計(jì)劃”的“標(biāo)書”。第12頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三1988年美國(guó)能源部和國(guó)家衛(wèi)生研究院率先在美國(guó)開(kāi)展人類基因組計(jì)劃，并經(jīng)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)由政府給予資助。此后，成立了一個(gè)國(guó)際間的合作機(jī)構(gòu)——人類基因組織(HumanGenomeOrganization)，由多個(gè)國(guó)家籌集資金和科研力量，積極參加這一國(guó)際性研究計(jì)劃。人類基因組計(jì)劃的研究概況

1988年第13頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三1989年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院成立了人類染色體研究中心，沃森出任第一任主任。人類基因組計(jì)劃的研究概況

1989年第14頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三1990年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)了“人類基因組計(jì)劃”，并于10月1日正式啟動(dòng)，由多國(guó)科學(xué)家參加、被稱為“生命科學(xué)阿波羅計(jì)劃”的人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)。預(yù)計(jì)用15年時(shí)間，投資30億美元，完成30億對(duì)堿基的測(cè)序，并對(duì)所有基因進(jìn)行繪圖和排序。美國(guó)承擔(dān)了全部任務(wù)的54%，英國(guó)33%，日本7%，法國(guó)2.8%，德國(guó)2.2%。中國(guó)于1999年9月加入人類基因組計(jì)劃并承擔(dān)了1%

的測(cè)序任務(wù)。人類基因組計(jì)劃的研究概況

1990年第15頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三1998年，生產(chǎn)DNA測(cè)序儀的最大廠家Perkin-Elmer(簡(jiǎn)稱PE)公司與文特爾領(lǐng)導(dǎo)的基因研究所合作成立了塞萊拉（Celera）遺傳信息公司，并宣布他們將利用最新技術(shù)在3年內(nèi)完成人類基因組的測(cè)序工作，這使得該計(jì)劃處于一種公私競(jìng)爭(zhēng)的狀態(tài)，從而加快了人類基因組的研究步伐。人類基因組計(jì)劃的研究概況

1998年第16頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三2000年6月26日，美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所所長(zhǎng)弗朗西斯·柯林斯、塞萊拉公司的董事長(zhǎng)兼首席科學(xué)家克萊格·文特爾、美國(guó)總統(tǒng)克林頓、英國(guó)首相布萊爾聯(lián)合宣布人類基因組工作草圖繪制成功。此后，人類基因組研究進(jìn)入繪制“完成圖”的階段。與“框架圖”相比，“完成圖”的覆蓋率從90％擴(kuò)展到100％，準(zhǔn)確率從99％上升到99.99％。人類基因組計(jì)劃的研究概況

2000年第17頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三2001年2月12日，參加繪制人類基因組圖譜的美、英、日、法、德、中6國(guó)科學(xué)家公布了更加準(zhǔn)確、清晰、完整的人類基因組圖譜，并指出人類基因總數(shù)只有3~3.5萬(wàn)個(gè),編碼序列占2%。2001年7月10日，中國(guó)“人類基因組計(jì)劃”重大項(xiàng)目秘書長(zhǎng)楊煥明教授宣布：在人類基因組完成圖的繪制工作中，中國(guó)已率先超額（1.13%）完成所承擔(dān)的任務(wù)。人類基因組計(jì)劃的研究概況

2001年第18頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三（一）遺傳圖（二）物理圖（三）序列圖（四）基因圖HGP包括以下研究?jī)?nèi)容第19頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三100-200kb克隆片段基因組測(cè)序的一般流程分級(jí)鳥槍測(cè)序法基因組DNA細(xì)菌人工染色體文庫(kù)DNA克隆的排序（物理作圖）

分段測(cè)序隨機(jī)打斷后克隆DNA測(cè)序DNA序列的組裝第20頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、

遺傳圖譜（連鎖圖譜）概念：指基因或分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，用厘摩（cM）表示。1cM的遺傳距離表示在100個(gè)配子中有1個(gè)重組子。在哺乳動(dòng)物中，遺傳圖譜上1cM的距離大約相當(dāng)于物理圖譜上1,000,000bp。人類基因組的全長(zhǎng)約3600cM第21頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

遺傳圖是將每條染色體上的基因或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置經(jīng)連鎖分析確定下來(lái)，構(gòu)成圖譜，因此，需借助相應(yīng)的遺傳標(biāo)記。

DNA技術(shù)的建立為人類提供了大量新的遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記有三代第22頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一代DNA遺傳標(biāo)記是RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。第23頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二代DNA遺傳標(biāo)記利用了存在于人類基因組中的大量重復(fù)序列：重復(fù)單位長(zhǎng)度在15-65個(gè)核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA；重復(fù)單位長(zhǎng)度在2-6個(gè)核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA，又稱為簡(jiǎn)短串聯(lián)重復(fù)（STR、STRP或SSLP）。衛(wèi)星DNA分類特征衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)的基本單位首尾相接，在基因組中呈不均勻分布，但主要集中于著絲粒、端粒等特定部位，高度或中等重復(fù)，分屬三個(gè)大家族。α衛(wèi)星DNA中等重復(fù)，基本單位長(zhǎng)171bp。小衛(wèi)星DNA中等重復(fù)，基本單位長(zhǎng)15~65bp。微衛(wèi)星DNA中等重復(fù)，基本單位長(zhǎng)2~8bp第24頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二代DNA遺傳標(biāo)記STRP的優(yōu)點(diǎn)是“多態(tài)性”與“高頻率”。由于(A)n，(CA)n，(CGG)n等短重復(fù)序列在進(jìn)化上不受選擇，在同一位點(diǎn)上可重復(fù)單位數(shù)量變化很大，配對(duì)時(shí)又容易產(chǎn)生“錯(cuò)配”，使這樣的位點(diǎn)遍布于整個(gè)基因組。已有5264個(gè)STRP為主體的遺傳標(biāo)記“連鎖圖”，平均分辨率已達(dá)600kb，其中第17號(hào)染色體上平均每495kb有一個(gè)標(biāo)記，第9號(hào)染色體上平均每767kb有一個(gè)標(biāo)記，整個(gè)基因組中只有三處標(biāo)記間距大于4Mb。第25頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三代DNA遺傳標(biāo)記，可能也是最好的遺傳標(biāo)記，是分散于基因組中的單個(gè)堿基的差異，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP），包括單個(gè)堿基的缺失、插入和替換。SNP中大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，即由一種嘧啶堿基替換另一種嘧啶堿基，或由一種嘌呤堿基替換另一種嘌呤堿基，顛換與轉(zhuǎn)換之比為1：2。SNP有可能在密度上達(dá)到人類基因組“多態(tài)”位點(diǎn)數(shù)目的極限。估計(jì)人類基因組中可能有300萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)！SNP與RFLP和STRP標(biāo)記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長(zhǎng)度變化作為檢測(cè)手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記。第26頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三遺傳圖譜繪制的意義“遺傳圖”的建立為人類疾病相關(guān)基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個(gè)遺傳學(xué)位點(diǎn)，相當(dāng)于把整個(gè)人類基因組劃分為5000多個(gè)小區(qū)，并分別設(shè)置了“標(biāo)牌”。如果在家系中證實(shí)該基因與某個(gè)標(biāo)記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標(biāo)記附近。如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個(gè)標(biāo)記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個(gè)標(biāo)記附近。如果該基因與某標(biāo)記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測(cè)該標(biāo)記與所研究的疾病基因可能非常接近。第27頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

人類基因組的物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點(diǎn)，STS）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。STS是基因組中任何單拷貝的長(zhǎng)度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列相關(guān)聯(lián)。物理圖主要內(nèi)容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。物理圖第28頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三序列圖人類基因組的核苷酸序列圖是分子水平上最高層次、最詳盡的物理圖。測(cè)定總長(zhǎng)約1米、由30億個(gè)核苷酸組成的全序列是人類基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)。人類所擁有的基因位點(diǎn)都是相同的，不同種族、不同個(gè)體的基因差異(人類基因組的多樣性)以及“正常”與“疾病”基因的差異，只是同一位點(diǎn)上的等位基因的差異。人類基因組計(jì)劃所提供的人類核酸序列圖，蘊(yùn)藏了決定我們生、老、病、死的所有遺傳信息，將成為人類認(rèn)識(shí)自我、改造自我－使人類健康長(zhǎng)壽的知識(shí)源泉，為21世紀(jì)現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奠定了基礎(chǔ)。第29頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。在人類基因組中鑒別出占具2%－5%長(zhǎng)度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過(guò)基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置?；驁D第30頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因圖CpG島的應(yīng)用

CpG島(CpGisland)：描述哺乳動(dòng)物基因組DNA中的一部分序列，其特點(diǎn)是C和G的總和超過(guò)4種堿基總和的50%，即每10個(gè)核苷酸約出現(xiàn)一次雙核苷酸序列CG。具有這種特點(diǎn)的序列僅占基因組DNA總量的10%左右。從已知的DNA序列統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的管家基因(House-Keepinggene)及約占40%的組織特異性基因的5‘末端含有CpG島，其序列可能包括基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子及第一個(gè)外顯子。因此，在大規(guī)模DNA測(cè)序計(jì)劃中，每發(fā)現(xiàn)一個(gè)CpG島，則預(yù)示可能在此存在基因。第31頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因圖計(jì)算機(jī)應(yīng)用及cDNA策略計(jì)算機(jī)應(yīng)用：通過(guò)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)（生物信息學(xué)）cDNA策略：把特定組織中的mRNA分離出來(lái)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA片段，建立EST位標(biāo)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。是染色體DNA某一區(qū)域內(nèi)所有可轉(zhuǎn)錄序列的分布圖，是基因圖的雛形。第32頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三節(jié)后基因組時(shí)代(Postgenomeera)*人類基因組計(jì)劃完成之后，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分。*科學(xué)研究已開(kāi)始進(jìn)入“后基因組時(shí)代”。主要是開(kāi)展蛋白質(zhì)組的研究。*有科學(xué)家形象地說(shuō)道：即使基因測(cè)序全部完成，也只好像是一本沒(méi)有姓名、只有號(hào)碼的電話簿。“后基因組時(shí)代”的最終目標(biāo)，是要把深?yuàn)W的DNA語(yǔ)言變成一本基因大百科全書。第33頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三人類基因組工程(humangenomeprojects)的含義盡管工程規(guī)模和要處理的信息量都很大，但其技術(shù)難度似乎不好與阿波羅計(jì)劃和邁哈頓計(jì)劃相比。是人類了解生命現(xiàn)象過(guò)程中的重要一步，但它所能夠回答的問(wèn)題是有限的！它不會(huì)立刻使我們的壽命延長(zhǎng)。不會(huì)使我們立刻知道人類疾病的發(fā)病機(jī)理和治療方法。不會(huì)告訴我們思維過(guò)程和個(gè)體發(fā)育的機(jī)制。不會(huì)告訴我們地球上的生命究竟是怎樣產(chǎn)生的。第34頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三人類基因組序列測(cè)完后（“后基因組時(shí)代”）的工作分析所有的這些基因及其編碼產(chǎn)物（主要是蛋白質(zhì)）是如何單獨(dú)和共同在生命過(guò)程中發(fā)揮作用的。在目前階段研究蛋白比研究基因難得多，而成千上萬(wàn)的結(jié)構(gòu)和功能都復(fù)雜多樣的蛋白分子才是生命過(guò)程的最后執(zhí)行者。我們現(xiàn)在還沒(méi)有有效的研究手段去揭示蛋白分子在生物體內(nèi)究竟完成什么功能、又是通過(guò)何種機(jī)制去完成其生物功能的等等。第35頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、基因組多樣性計(jì)劃不同人種、不同民族基因組的異同關(guān)系。探討人類進(jìn)化和種族演化的歷史。個(gè)體化用藥。疾病易感性。第36頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、功能基因組學(xué)

完成一個(gè)生物體全部基因組測(cè)序后即進(jìn)入后基因組測(cè)序階段——詳盡分析序列，描述基因組所有基因的功能，包括研究基因的表達(dá)及其調(diào)控模式，這就是功能基因組學(xué)（functionalgenomics）。第37頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三（一）鑒定DNA序列中的基因（二）同源搜索設(shè)計(jì)基因功能（三）實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)基因功能（四）描述基因表達(dá)模式功能基因組學(xué)的主要具體內(nèi)容包括以下方面

第38頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三功能基因組學(xué)研究策略及主要內(nèi)容第39頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、比較基因組學(xué)比較基因組學(xué)(comparativegenomics)涉及比較不同物種的整個(gè)基因組，是利用生物在進(jìn)化上的親緣關(guān)系，來(lái)比較它們與人類之間的相似與相異，以便深入理解每個(gè)基因組的功能和進(jìn)化關(guān)系。第40頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、環(huán)境基因組學(xué)

與環(huán)境因素相關(guān)的疾病遺傳易感性基因五、疾病基因組學(xué)

分離、分析疾病的致病基因和相關(guān)基因，并研究其致病機(jī)制六、藥物基因組學(xué)

研究包括藥物在內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)引起機(jī)體反應(yīng)上的遺傳差異第41頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

以生物大分子為研究對(duì)象，以計(jì)算機(jī)為工具，運(yùn)用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的生物信息數(shù)據(jù)的一門科學(xué).七、生物信息學(xué)http://www.ebi.ac.uk/embl/http://www.ddbj.nig.ac.jp/。第42頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)基因定位與克隆人類基因組計(jì)劃的完成，最重要的后續(xù)工作是運(yùn)用一定的方法，將各個(gè)基因確定到染色體的實(shí)際位置。基因定位對(duì)提高人類對(duì)疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認(rèn)識(shí)有重要意義。第43頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.連鎖分析（Linkageanalysis）基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位?；蚨ㄎ坏姆椒ㄖ亟M值（recombinationfraction）是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）遺傳標(biāo)記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德?tīng)柗绞竭z傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。第44頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因定位的方法

常用的連鎖分析方法為家系連鎖分析法采用對(duì)數(shù)優(yōu)勢(shì)記分法(Logoddsscore，LOD)數(shù)學(xué)模式數(shù)學(xué)原理：在獲得兩個(gè)基因位點(diǎn)的某上份系譜分析數(shù)據(jù)后，將假定這兩個(gè)位點(diǎn)以某一重組值連鎖的似然性，與假定這兩個(gè)位點(diǎn)不連鎖的似然性相對(duì)較，從二者比值的對(duì)數(shù)值域，判斷支持和反對(duì)連鎖的優(yōu)勢(shì)。Z(θ)=log10————L(θ)L(0.5)L(0.5)表示重組值為50%，即完全不連鎖的似然性。Z≥3時(shí)可確定連鎖，Z≤-2時(shí)可否定連鎖，-2<Z<3時(shí)，須做進(jìn)一步分析第45頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因定位的方法2、體細(xì)胞雜交法基因定位：體細(xì)胞：即生物體除生殖細(xì)胞外的任一細(xì)胞。體細(xì)胞雜交的概念：也稱細(xì)胞融合（cellinfusion），是將來(lái)源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱雜種細(xì)胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。

對(duì)象：人的細(xì)胞鼠類：大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠雜種細(xì)胞的特點(diǎn)：在繁殖傳代過(guò)程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來(lái)。第46頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。第47頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三HAT選擇系統(tǒng)人的突變細(xì)胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細(xì)胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）A為氨基蝶呤，可阻斷正常的DNA合成(嘌呤及TMP合成受抑制)T為胸腺嘧啶脫氧核苷，在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料第48頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無(wú)TK，無(wú)法合成胸腺嘧啶。(嘧啶合成障礙)雜種細(xì)胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶(嘌呤和嘧啶都可以正常合成)人細(xì)胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無(wú)法利用次黃嘌呤通過(guò)旁路合成DNA(嘌呤合成障礙)因此在HAT培養(yǎng)基上，第49頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三將篩選出來(lái)的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號(hào)染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。第50頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.原位雜交和熒光原位雜交原位雜交（insituhybridization）是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。原理堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，可檢測(cè)細(xì)胞基因組中的同源部分。第51頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三原位雜交的特點(diǎn)雜交在載玻片上的中期染色體上進(jìn)行，而不是在溶液和膜上進(jìn)行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)度來(lái)確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定位。第52頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標(biāo)記探針