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文檔簡介
反相高效液相色譜
reversed-phasehigh-performanceliquidchromatography
高效液相的簡介概念:高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支,以液體為流動相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測,從而實現(xiàn)對試樣的分析。
發(fā)展歷史:1906年俄國植物化學(xué)家茨維特(Tswett)首次提出“色譜法”(Chromotography)和“色譜圖”(Chromatogram)的概念。1930年以后,相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。1952年,英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge提出了關(guān)于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法。1958年,基于Moore和Stein的工作,離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn),這是近代液相色譜的一個重要嘗試,但分離效率尚不理想。1960年中后期,氣相色譜理論和實踐發(fā)展,以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步,液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。1970年中期以后,微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜,進(jìn)一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1990年以后,生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展,為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題,如人類基因組計劃,蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。HPLC特點:高效液相色譜法有“四高一廣”的特點:①高壓:流動相為液體,流經(jīng)色譜柱時,受到的阻力較大,為了能迅速通過色譜柱,必須對載液加高壓
②高速:分析速度快、載液流速快,較經(jīng)典液體色譜法速度快得多,通常分析一個樣品在15~30分鐘,有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成,一般小于1小時
③高效:分離效能高??蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果,比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍
④高靈敏度:紫外檢測器可達(dá)0.01ng,進(jìn)樣量在μL數(shù)量級⑤應(yīng)用范圍廣:百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析,特別是高沸點、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析,顯示出優(yōu)勢
HPLC分類:按照分離機(jī)理的不同,可分為以下幾類
HPLC1、吸附色譜法(adsorptionchromatography):以吸附劑為固定相的色譜2、液-液分配色譜法(liquid-liquidchromatography):液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑,分離時,組分溶入兩相,不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離3、離子交換色譜法(ionexchangechromatography):以離子交換劑為固定相的色譜方法,組分因和離子交換劑親4、空間排斥色譜法(stericexclusionchromatography):空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì),即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離
5、親和色譜法(lighperformanceaffinitychromatography):是利用或模擬生物分子之間的專一性作用,從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法6、手性色譜法(chiralchromatography):對映體在普通條件下的理化性質(zhì)是相同的,因此分離對映體需要在手性條件下進(jìn)行。分離對映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對映體與一定的手性衍生化試劑反應(yīng),使其由對映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍τ丑w,再利用他們理化性質(zhì)的差異,用一般的色譜條件進(jìn)行分離。直接法不需作衍生化反應(yīng),直接利用手性色譜柱或手性流動相進(jìn)行分離,應(yīng)用較多液液分配色譜法中的化學(xué)鍵合固定相:目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的,使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位,是應(yīng)用最廣的色譜法。按照固定相和流動相極性的不同,分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。分配色譜法正相色譜法(normalphasechromatography)固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法,簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相,正相色譜的流動相一般為極性較小的有機(jī)溶劑。在正相色譜中,極性小的組分由于K值較小先流出,極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。反相色譜法(reversedphasechromatography)流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法,簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相,最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠,還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱,極性較小的組分后流出。流動相中有機(jī)溶劑的比例增加,流動相極性減小,洗脫力增強(qiáng)。反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。高效液相色譜的結(jié)構(gòu)及原理鈣調(diào)蛋白肽段的反相HPLC分離實驗實驗儀器和試劑:儀器:反相高效液相色譜儀離心機(jī)試劑:乙腈水0.1%TFA溶劑鈣調(diào)蛋白消化酶實驗步驟:1、打開HPLC,設(shè)定所需數(shù)值,如:波長(210nm),流動相流量和比例(乙腈5%到70%v/v梯度)2、樣品處理:樣品消化,真空離心濃縮3、待基線平衡和壓力穩(wěn)定后,注射進(jìn)樣4、收集與監(jiān)測器上出現(xiàn)的吸收峰相對應(yīng)的組分實驗就結(jié)果速:實驗端注意毫事項踢:1、蛋喜白質(zhì)撿是具昨有邊車緣疏具水性后的偶檢極離誕子,放因此頑色譜流柱必秤須是絡(luò)帶有艦芳族刺或者崖脂族申的硅煉膠2、RP跪-H導(dǎo)PL慢C要用福有機(jī)值溶劑搶來分辨離分榮子,朱此類內(nèi)溶劑世會破清壞蛋蕩白質(zhì)劑的三俘維結(jié)灰構(gòu),淹因此娛此種摟方法訪只適即合用裕來分慰離制友備化柿學(xué)分耀析用潔
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