動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的歷史與展望課件

從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)到組織工程

施秀惠國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)生命科學(xué)系嚴(yán)重急性呼吸道癥候群

SARS

(severeacuterespiratorysyndrome)病原體究竟是冠狀病毒?副黏液病毒?或其他?臺(tái)灣與香港的研究進(jìn)展有落差!重要關(guān)鍵:是否尋獲有感受性的細(xì)胞株?

何謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)？

植物組織培養(yǎng)

(planttissueculture)金線蓮非洲菫生物組成之階層

(Thehierarchyofbiologicalorder)分子

(molecule)細(xì)胞(cell)組織(tissue)器官(organ)系統(tǒng)(system)個(gè)體(organism)族群(population)群聚(community)生態(tài)系(ecosystem)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物組織培養(yǎng)通稱(chēng)的動(dòng)物組織培養(yǎng)

(ATC-Animaltissueculture)

究竟在培養(yǎng)什麼?蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內(nèi)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)之創(chuàng)始通稱(chēng)的動(dòng)物組織培養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)象為(動(dòng)物)細(xì)胞層級(jí)增殖基礎(chǔ)為有絲分裂,不涉及減數(shù)分裂獲得初級(jí)培養(yǎng)(primaryculture)或細(xì)胞株(cellline)Clone-株,克隆invitroculture(體外培養(yǎng))vs.invivo(活體)

如何培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞？

兩種基本策略

初級(jí)組織塊培養(yǎng)法(primaryexplantculture)

分散細(xì)胞培養(yǎng)法(dispersedcellculture)

草蝦淋巴器官組織塊細(xì)胞培養(yǎng)吳郭魚(yú)生殖腺單層細(xì)胞培養(yǎng)基本設(shè)備無(wú)菌操作檯-配備

HEPAfilter倒立顯微鏡倒立顯微鏡和25T培養(yǎng)瓶培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)器材:培養(yǎng)皿、盤(pán)、瓶等

培養(yǎng)基:aminoacids,vitamins,coenzymes

添加物:血清、生長(zhǎng)激素等

培養(yǎng)條件:氣相、溫度等利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之

優(yōu)勢(shì)和限制

優(yōu)勢(shì)

控制下的環(huán)境性質(zhì)已知且均質(zhì)化的標(biāo)本

經(jīng)濟(jì)性限制

經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)之需求度高量產(chǎn)之困難

細(xì)胞株之穩(wěn)定性

最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)-污染(contamination)

--自始至今皆然污染物的種類(lèi)與特徵偵測(cè)方法與操作原則交叉污染

預(yù)防污染方法

消毒(Sterilization)

物理法、化學(xué)法、機(jī)械法無(wú)菌操作(Aseptictechnique)

學(xué)習(xí)之宗旨與精髓

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之成就與貢獻(xiàn)

病毒學(xué)研究

體外(invitro)培養(yǎng)病毒

1937:黃熱病毒

1949:小兒麻痺病毒……..製備疫苗

1954諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng):Enders,Weller，Robbins試想:如果開(kāi)發(fā)出SARS,(禽)流感或

AIDS疫苗?!HPV疫苗-子宮頸癌新剋星HPV-人類(lèi)乳突病毒,經(jīng)由性行為傳染,引起子宮頸癌HPV16型疫苗之人體試驗(yàn)(2002/11新英格蘭醫(yī)學(xué)雜誌刊登)全美16個(gè)醫(yī)學(xué)中心,2392位16~23歲女性,同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組-1194人,對(duì)照組-1198人接種疫苗後追蹤17.4個(gè)月結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組-無(wú)人發(fā)生持續(xù)性HPV感染對(duì)照組-9個(gè)HPV導(dǎo)致之子宮頸癌前病變遺傳學(xué)研究

核型(karyotype)分析

例如:胎兒診斷

羊膜或絨毛膜穿刺

遺傳代謝疾病診斷

其他重要應(yīng)用基因工程作為基因之增殖與表現(xiàn)系統(tǒng)癌癥研究

基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物人工生殖

潛力與展望組織工程學(xué)

(Tissueengineering)

-2000年5月美國(guó)《時(shí)代》雜誌列為

未來(lái)十大熱門(mén)工作之首主要致力於組織和器官的再生與形成在一個(gè)模仿組織與器官形狀的材料中種入細(xì)胞，使細(xì)胞依照模型長(zhǎng)成新的組織與器官，以修復(fù)人體組織的缺損。前驅(qū):美國(guó)麻州總醫(yī)院外科醫(yī)師韋肯逖(JosephVacanti）麻省理工學(xué)院化工系教授藍(lán)格(RobertLanger）構(gòu)想:結(jié)合醫(yī)學(xué)與材料工程的知識(shí)背景，研發(fā)製造能修復(fù)人體病變組織與器官的零件，以克服器官捐贈(zèng)來(lái)源短缺的困境。組織工程的開(kāi)始成果1.體外培養(yǎng):1992年在多孔狀結(jié)構(gòu)高分子材料上培養(yǎng)出軟骨細(xì)胞，並形成新的軟骨組織。2.活體培養(yǎng):老鼠背上培養(yǎng)出人耳形狀的軟骨。

組織工程三大元件-細(xì)胞、支架、訊號(hào)

細(xì)胞

組織生成↗↖訊號(hào)支架

細(xì)胞

-組織再生的關(guān)鍵策略:採(cǎi)集少量的自體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)增殖後，再運(yùn)用於修復(fù)體內(nèi)器官。兩種細(xì)胞類(lèi)型：已分化完全的「成熟細(xì)胞」，具有分化成其他細(xì)胞能力的「幹細(xì)胞」。

幹細(xì)胞(stemcell)培養(yǎng)

幹細(xì)胞是身體所有組織的前身來(lái)源:胚胎-完整潛能(totipotent)或豐富潛能(pluripotent)細(xì)胞成體-多重潛能或特定功能(multipotent)

細(xì)胞NIH(2000May)完整潛能豐富潛能囊胚期細(xì)胞NIH(2000May)骨髓神經(jīng)細(xì)胞心肌細(xì)胞胰島細(xì)胞預(yù)期將愈來(lái)愈多研究現(xiàn)況與應(yīng)用目標(biāo)疾病與受傷之治療

例如:脊髓傷害之癱瘓(大鼠)、帕金森氏癥、阿茲海默癥、糖尿病、黏多糖癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等器官移植具備無(wú)限潛力但受倫理規(guī)範(fàn)胚胎幹細(xì)胞研究規(guī)範(fàn)

(Science2001)第一級(jí):絕對(duì)禁止(法、瑞士、西、冰島、波蘭)第二級(jí):現(xiàn)有細(xì)胞株,不得再以受精卵製造新細(xì)胞株(美國(guó))第三級(jí):可使用人工流產(chǎn)與人工生殖之多餘胚胎

(日本、加、澳洲、以色列)

我國(guó)

2002/2/19公告-

「胚胎幹細(xì)胞研究倫理規(guī)範(fàn)」第四級(jí):可為研究目的製造新胚胎

(大陸、美私人經(jīng)費(fèi)贊助者)人造血管

-組織工程皮膚成功的前提Acollagenbiopolymer(Blacketal.1998):角質(zhì)細(xì)胞真皮纖維母細(xì)胞臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞coculture→endothelializedskinequivalent(ESE)人工關(guān)節(jié)-軟骨再生1.第一次手術(shù):從病人關(guān)節(jié)軟骨中未受力的部分，取出一片約為葡萄乾大小的健康軟骨組織。2.分離出軟骨細(xì)胞並經(jīng)三星期的體外

培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)增加約10～20倍。3.第二次手術(shù):清理軟骨受損的部分，從下方骨頭部位取出一片約與傷口大小相同的骨膜，縫在傷口上方，再將軟骨細(xì)胞注射到骨膜下方。結(jié)果:經(jīng)過(guò)復(fù)健一年後即可恢復(fù)