消毒液微生物檢測研究

消毒液微生物檢測研究摘要：本文描述了一種葡萄糖醛酸苷酶生物檢測法，用于從在硬質(zhì)表面上使用消毒劑來檢測殘留的殺菌活性；在此分析中，使用了甲醛，乙醇，異丙醇，氯和包含2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇的制劑。消毒后一周，氯和市售制劑均顯示出殺菌活性，分別為53.5％和98.2％，具有良好的微生物檢測效果。關(guān)鍵詞：消毒液；微生物；檢測由于微生物檢測法易于操作且可提供快速結(jié)果，因此已廣泛用于評估化學(xué)制品的毒性。大腸桿菌產(chǎn)生一種酶，即b-葡糖醛酸糖苷酶（BGU），該酶能夠水解含氟底物，例如4甲基傘形酰-bD-葡糖醛酸（MUG）。通過使用這種酶，有可能設(shè)計(jì)一種快速簡便的生物檢測法（熒光表面測試），用于檢測和定量檢測可能在液體介質(zhì)中容易釋放的惰性材料上微量消毒劑的存在。前提是在將預(yù)先消毒的載體引入裝有MUG和大腸桿菌的試管中后，只有在沒有活性細(xì)菌（因此也沒有BGU活性）的情況下，熒光才會消失，這表明存在痕量抑制濃度的消毒劑。如果仍然存在活性細(xì)菌，則試管將顯示熒光。如果此熒光低于未使用消毒劑的控制管發(fā)出的熒光，則可以相對于已知的測試消毒劑濃度定量殘留的消毒劑活性，因?yàn)檫@種抑制作用與有毒物質(zhì)的濃度成正比。消毒液微生物檢測方法鑒定復(fù)雜樣品中存在的細(xì)菌和病毒可用于疾病診斷，產(chǎn)品安全性，環(huán)境表征和研究。已證明基于陣列的方法可用于以合理的成本在單個測定中檢測數(shù)千種已測序的微生物。我們設(shè)計(jì)了一種泛微生物檢測陣列（MDA）以檢測所有已知的病毒（包括噬菌體），細(xì)菌和質(zhì)粒，并開發(fā)了一種新穎的統(tǒng)計(jì)分析方法，可從與該陣列雜交的復(fù)雜樣品中鑒定出生物的混合物。與文獻(xiàn)中的其他微生物檢測/發(fā)現(xiàn)陣列相比，該陣列具有更廣泛的細(xì)菌和病毒靶標(biāo)覆蓋范圍，并且基于最新的序列數(shù)據(jù)和每個靶標(biāo)的探針更多。為所有測序的病毒和細(xì)菌完整基因組，片段和質(zhì)粒選擇家族特異性探針。探針經(jīng)設(shè)計(jì)可耐受某些序列變異，從而能夠檢測與測序生物具有同源性的趨異物種，并且與人類基因組序列無顯著匹配。在對帶有一種或多種病毒的加標(biāo)樣品進(jìn)行的盲法測試中，MDA能夠正確識別物種或菌株。通過PCR證實(shí)，在臨床糞便，血清和呼吸道樣品中，MDA能夠檢測和鑒定樣品中多種病毒，噬菌體和細(xì)菌至家族和物種水平。MDA可用于識別復(fù)雜樣品中存在的病毒和細(xì)菌。將大腸桿菌W3110thyF2在37°C搖動下在10ml補(bǔ)充了葡萄糖（20mg/ml）和胸腺嘧啶（0.05mg/ml）的Vogel-Bonner基本培養(yǎng)基（VB）中搖動生長。毫升）（均來自Sigma），直到達(dá)到對數(shù)后期（根據(jù)生長曲線，大約在18小時）。然后將培養(yǎng)物以3,0303g離心5分鐘以消除殘留的葡萄糖，并將沉淀物重懸于僅補(bǔ)充有胸腺嘧啶（0.05mg/ml）（VBT）的10mlVB中。該細(xì)胞懸液在使用前保持在4℃。微生物測試是化妝品安全性的關(guān)鍵方面。為了滿足化妝品法規(guī)（EC）1223/2009的要求，必須確定原材料，散裝產(chǎn)品和配制的最終化妝品的微生物質(zhì)量。Intertek的微生物測試套件包括質(zhì)量控制測試和研發(fā)支持，可幫助我們的客戶確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。防腐劑測試測試涉及根據(jù)相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)評估防腐劑系統(tǒng)的抗菌功效：國際標(biāo)準(zhǔn)ISO11930歐洲藥典（EP）第5.1.3章法國標(biāo)準(zhǔn)NFT75-611美國藥典（USP）第<52>章可行總數(shù)按照ISO16212和ISO21149標(biāo)準(zhǔn)或歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)控制用于批次釋放的微生物清潔度。中溫細(xì)菌的定量測試（NFISO21149）酵母和真菌的定量計(jì)數(shù)（NFISO16212）微生物的研究與鑒定ISO18415：2007：特定和非特定微生物ISO18416：2007：白色念珠菌ISO22718：2006：金黃色葡萄球菌ISO21150：2006：大腸桿菌ISO22717：2006：銅綠假單胞菌特定生物微生物分析測試了以下消毒劑：2％甲醛（A.Matachana，SA，巴塞羅那，西班牙），20％乙醇和70％異丙醇（默克），2％次氯酸鈉（Sigma）和CR-36MURAL（J。Collado，SL，西班牙馬德里），由0.1875％2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇，0.0675％2,2,49-三氯-29羥苯基醚和1％N-烯丙基-N組成的商業(yè)制劑，N-二甲基氯化銨銨。除使用未經(jīng)稀釋的CR-36MURAL外，每種消毒劑均用滅菌和蒸餾水制備。然后將總共30個載體（直徑1厘米，長0.8厘米的玻璃半圓柱體）與硬表面載體測試中使用的載體類似，引入裝有50ml消毒劑的無菌搖瓶中。振搖以消除任何氣泡后，將搖瓶在室溫下放置10分鐘，然后將載體移出并放在襯有滅菌濾紙的皮氏培養(yǎng)皿中放置30分鐘，直到完全干燥。之后，立即將五種干燥的載體分別引入試管中，每支試管中均含有1.8ml的VBT并補(bǔ)充有MUG（0.01mg/ml）（Sigma），并劇烈搖動10s。將在每個實(shí)驗(yàn)之前立即從保存于4°C的懸浮液中制備的，在600nm處具有0.0560.002（CS0.05）吸光度的大腸桿菌細(xì)胞懸浮液添加到每個試管中（每管0.2ml）并在在37°C下?lián)u動水浴。重要的是預(yù)測并避免在產(chǎn)品的運(yùn)輸，存儲或處理過程中可能發(fā)生的成品物理狀態(tài)變化。通過將產(chǎn)品暴露于變化的溫度，濕度，紫外線，機(jī)械應(yīng)力等各種條件下，我們可以預(yù)測產(chǎn)品在貨架期內(nèi)可能會遭受的條件，并查看這些條件是否對產(chǎn)品的質(zhì)量和性能產(chǎn)生負(fù)面影響。安全。進(jìn)行穩(wěn)定性測試的另一個重要原因是確定產(chǎn)品的最小耐久性及其打開后的時間（PAO）。除了產(chǎn)品制劑的物理穩(wěn)定性外，還在穩(wěn)定性測試過程中檢查了制劑與初級包裝之間的相容性。包裝的類型可能會影響成品的穩(wěn)定性，例如將包裝中的物質(zhì)浸出到產(chǎn)品配方中。因此，應(yīng)該在惰性包裝（例如玻璃容器）以及將要出售產(chǎn)品的最終產(chǎn)品包裝中進(jìn)行穩(wěn)定性測試。如果使用不同的包裝類型，建議在每種包裝類型中測試產(chǎn)品。穩(wěn)定性測試分為兩種：實(shí)時測試和加速測試。實(shí)時穩(wěn)定性測試會在產(chǎn)品的整個保質(zhì)期內(nèi)對其進(jìn)行監(jiān)視（如果要聲明為一年的保質(zhì)期，則必須對產(chǎn)品進(jìn)行一年的監(jiān)視）。另一方面，加速測試是在加速條件下進(jìn)行的，例如高溫。因此，縮短了測試周期，并且這種測試通常需要3個月。在某些情況下，必須再次進(jìn)行穩(wěn)定性和相容性測試，例如產(chǎn)品重新配方，主要包裝材料的更換，制造工藝或所用設(shè)備的任何重大變化等。最后，我們需要強(qiáng)調(diào)測試報(bào)告的重要性。該報(bào)告必須提供有關(guān)測試的所有必要信息；它必須包括一個明確的結(jié)論以及負(fù)責(zé)測試的人員的簽名。210分鐘后，用Perkin-ElmerLS30熒光計(jì)在340nm激發(fā)和445nm發(fā)射下測量每個管中的熒光。干燥后24小時和7天，通過相同的程序分析其他干燥的載體。以相同的方式同時制備對照，但沒有消毒劑。通過計(jì)數(shù)胰蛋白酶大豆瓊脂平板（類毒素）上的微生物，將每個實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時存在的微生物數(shù)量確定為CFU。通過最小二乘線性回歸由每CFU每分鐘釋放的甲基傘形酮的量計(jì)算BGU酶活性。通過使用溶解在VBT中的甲基傘形酮（Sigma）的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定釋放量。如前所述（3）計(jì)算痕量消毒劑對載體產(chǎn)生的大腸桿菌BGU活性的抑制作用，結(jié)果表示為相對于對照的抑制百分率：抑制百分率5（EAc2EAs）3100/EAc，其中EAc和EA分別是對照（不含消毒劑）和樣品（含消毒劑）的EA。在不同的日子分析三個重復(fù)，每個重復(fù)帶有五個載體，以獲得抑制手段。載體釋放的每種消毒劑的平均濃度計(jì)算如下，制備一系列裝有VBT-MUG（1.8ml）和CS0.05（0.2ml）的試管，每支試管中均含有已知濃度的消毒劑。將試管進(jìn)行孵育，并如上所述測量其熒光。如上所述計(jì)算抑制百分比，并且獲得劑量-響應(yīng)曲線，其中在x軸上的log10濃度和在y軸上的相應(yīng)抑制百分比。通過使用這些劑量反應(yīng)曲線的回歸線，并了解浸沒在每種消毒劑中的載體所獲得的抑制百分比的平均值，可以通過使抑制百分比回歸對應(yīng)于已知log10的濃度來計(jì)算出載體釋放的消毒劑的平均濃度。同時，通過學(xué)生t檢驗(yàn)，以百分抑制值的算術(shù)平均值，將含有已知濃度消毒劑的試管的抗菌效力確定為MIC。由上述劑量反應(yīng)曲線計(jì)算50％有效濃度EC50，作為抑制50％所需的物質(zhì)濃度（ppm）。二、消毒液微生物檢測結(jié)果分析所測試的五種消毒劑的EC50和MIC指的是與無消毒劑的對照組相比的BGU活性，氯，甲醛和CR-36表現(xiàn)出高毒性，而乙醇和異丙醇表現(xiàn)出較低的毒性。所有實(shí)驗(yàn)均在密閉的試管中進(jìn)行，以避免在檢測過程中因揮發(fā)而損失消毒劑。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時執(zhí)行的CFU計(jì)數(shù)，在與每種消毒劑的MIC相對應(yīng)的濃度下未觀察到細(xì)菌生長。CR-36起初似乎不如氯和甲醛活潑。不過，考慮到CR-36的殺菌成分（2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇（溴硝醇）僅占其成分的0.1875％），MIC和EC50可能分別為0.62和0.022ppm，如果僅考慮溴硝酚的濃度，則分別為333ppm和11.6ppm（而不是333ppm）。在這項(xiàng)研究中，沒有嘗試檢查由CR-36引起的抑制是否僅由溴硝酚產(chǎn)生，并且材料對CR36的良好吸收可能有助于這些結(jié)果。氯，甲醛和CR-36濃度的增加導(dǎo)致BGU活性的逐漸抑制。但是，測試的其他兩種物質(zhì)，乙醇和異丙醇，在低濃度下會刺激BGU活性（抑制率低于對照組）。在這兩種情況下，這種效果均與測試結(jié)束時觀察到的CFU的增加或BGU活性（每個細(xì)胞的BGU活性）的刺激不一致，因此，這可能是由于細(xì)胞通透性增加引起的，類似于在BGU活性方面觀察到的對二甲亞砜的影響。亞毒性濃度下BGU活性的這種刺激可能與基質(zhì)或其酶解產(chǎn)物的不滲透性降低有關(guān)。只有浸入CR-36和2％氯溶液中的載體顯示出BGU活性的殘留抑制（P，0.05）。對于CR-36，這種抑制作用持續(xù)了至少一周，實(shí)際上沒有損失容量，而2％氯溶液的抑制活性在7天后下降到其容量的一半左右（53.5％）。至于其他三種消毒劑，零時零時只有2％的甲醛顯示出一定的抑制作用，盡管與沒有消毒劑的對照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在每次測試結(jié)束時確定相對于接種物的CFU數(shù)量時，在所有情況下都發(fā)現(xiàn)熒光的全部或部分抑制與微生物數(shù)量的減少相吻合。這表明BGU活性的降低是由于細(xì)菌數(shù)量的減少，而不是由于某些BGU抑制劑能夠抑制該酶，但對細(xì)菌無毒，因此產(chǎn)生了BGU的特異性抑制。氯的百分抑制值的標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)大于其他四種消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一項(xiàng)關(guān)于氯對大腸桿菌BGU活性影響的研究中認(rèn)為低濃度氯引起的細(xì)胞通透性的改變可以通過在CFU數(shù)量減少的情況下促進(jìn)酶或底物的運(yùn)輸來促進(jìn)EA。在討論中的測試中，每毫升CFU的數(shù)量比所觀察到的BGU活性的預(yù)期值小2.3至4.5倍。初步結(jié)果表明，通常還可能以比在玻璃載體上檢測到的濃度更高的濃度檢測化合物（例如戊二醛或甲醛）的殘留物。因此，該方法可用于控制可能導(dǎo)致健康問題的材料上的殘留消毒劑或滅菌劑。這種方法在環(huán)境上的應(yīng)用還可以是評估農(nóng)藥或其他粘附在表面上的物質(zhì)的持久性。另外，其具有簡單，快速和便宜的優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于其他酶促熒光底物的方法的開發(fā)，可以將其應(yīng)用于除大腸桿菌以外的其他微生物，從而擴(kuò)大該生物檢測的范圍。結(jié)語：本文主要分析消毒液微生物檢測方法，通過實(shí)踐分析，消毒液微生物檢測效果非常好，具有簡單和快捷的優(yōu)點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：[1]孫廷麗,黎玉蓮,周少璐,謝小保.消毒產(chǎn)品消毒效果檢測方法及其影響因素分析[J].中國洗滌用品工業(yè),2020(Z1):98-106.[2]趙奇韜,周如玉,梅予鋒,王娟.過氧化氫銀離子消毒劑控制微生物污染的效果檢測[J].口腔