生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制

關(guān)于生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制第1頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三概述利用人體內(nèi)的天然物質(zhì)治療人類的疾病或達(dá)到某種醫(yī)學(xué)效果一直是醫(yī)學(xué)上的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。20世紀(jì)70年代以來(lái)產(chǎn)生了DNA重組技術(shù)，這種新技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的主體，近年來(lái)首先在醫(yī)藥領(lǐng)域獲得了飛速發(fā)展。生物技術(shù)的應(yīng)用2/3用于醫(yī)藥，生物技術(shù)新型藥物和疫苗已有50多種產(chǎn)品投放市場(chǎng)，400多種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，2000多種在臨床前研究。據(jù)報(bào)道，國(guó)外6500萬(wàn)人接受重組乙肝疫苗、100萬(wàn)人接受t-PA治療，超過(guò)50萬(wàn)人使用EPO，每天約有1000萬(wàn)人接受重組人胰島素的治療。第2頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)和管理按生物制品的要求進(jìn)行，不僅對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量實(shí)施有效控制，而且特別重視對(duì)生產(chǎn)工藝的全過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制,其中包括對(duì)每個(gè)生產(chǎn)步驟的驗(yàn)證、質(zhì)量檢定（QC）、質(zhì)量保證部（QA）對(duì)生產(chǎn)和質(zhì)量檢定的全過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的管理。第3頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、概念：2、分類｛生物技術(shù)藥物重組DNA藥物重組蛋白質(zhì)藥物采用DNA重組技術(shù)或其他新生物技術(shù)生產(chǎn)的治療和預(yù)防藥物。第4頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

1、重組蛋白質(zhì)或重組多肽藥物包括：

細(xì)胞因子類：rIFN、IL-2、EPO等；抗細(xì)胞素治療：CD4可溶性受體等；重組溶血栓類：rSK、rSAK等；人源化單克隆抗體制劑；重組疫苗和菌苗制劑。第5頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、重組DNA藥物包括：寡核苷酸藥物：反義核酸等；基因藥物：腺病毒-IL-2、腺相關(guān)病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53細(xì)胞治療制劑：抗原致敏的人樹(shù)突狀細(xì)胞DNA疫苗：治療乙型肝炎、愛(ài)滋病的核酸疫苗等。第6頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三我國(guó)生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展以及人類基因組計(jì)劃的完成和遺傳病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。自1982年第一個(gè)基因重組藥物—重組胰島素上市以來(lái)，全世界約有60余種重組產(chǎn)品開(kāi)發(fā)成功，包括基因工程藥物、基因工程抗體，重組疫苗、反義核苷酸藥物、基因治療藥物、DNA疫苗。我國(guó)在“七五”、“八五”、“九五”期間國(guó)家“863”高技術(shù)項(xiàng)目支持下，先后建立一系列基因重組制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控方法，共完成國(guó)家一類、二類新藥20余種產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。第7頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的依據(jù)一、主要依照《重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量控制要點(diǎn)》、《中國(guó)生物制品規(guī)程》、《中國(guó)藥典》等要求進(jìn)行。二、參考世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國(guó)FDA頒布的指南、ICH文件和《歐洲藥典》。檢定標(biāo)準(zhǔn)、檢定方法：準(zhǔn)確可靠、切實(shí)可行；保證產(chǎn)品安全、有效。第8頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的內(nèi)容1、目標(biāo)產(chǎn)品的均一性2、建立目標(biāo)產(chǎn)品生物學(xué)活性或免疫學(xué)效價(jià)測(cè)定方法3、研究建立目標(biāo)產(chǎn)品的免疫學(xué)活性的測(cè)定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)4、研究建立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品5、建立目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)相關(guān)雜質(zhì)的限量分析方法和標(biāo)準(zhǔn)6、制定出保證上述生物技術(shù)產(chǎn)品臨床安全、有效、與WHO標(biāo)準(zhǔn)相一致的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范化的檢定方法第9頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

研究建立靈敏、穩(wěn)定的理化性質(zhì)、純度、含量的測(cè)定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

第10頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

研究建立目標(biāo)產(chǎn)品的生物學(xué)功效的測(cè)定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；建立用于藥物生物學(xué)功效檢定用的細(xì)胞系和動(dòng)物模型。第11頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

運(yùn)用生化標(biāo)準(zhǔn)化原則，以WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，研制出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考對(duì)照品。在效價(jià)定義上要求與國(guó)際單位一致；沒(méi)有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的新藥，則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品要求自行研制國(guó)家參比品。第12頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

外源DNA、菌體蛋白質(zhì)、細(xì)菌內(nèi)毒素以及病毒、支原體、細(xì)菌等在工藝中加入有害物質(zhì)的檢測(cè)。第13頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三重組產(chǎn)品質(zhì)量控制上存在的難點(diǎn)建立重組藥物的生物學(xué)活性測(cè)定方法；理化測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性；人源化單抗中的人源化程度檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)研究；重組人白蛋白等大劑量重組產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)問(wèn)題；反義核酸藥物理化特性測(cè)定和效力測(cè)定，即如何評(píng)價(jià)反義核酸的體內(nèi)及體外活力；基因治療藥物的安全性評(píng)價(jià)包括反轉(zhuǎn)錄病毒、生物分布和效力測(cè)定；DNA疫苗的安全性和效力檢測(cè)方法研究；干細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立（干細(xì)胞鑒定及活力測(cè)定）。第14頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三我國(guó)基因工程產(chǎn)品安全管理

法規(guī)和技術(shù)指南《傳代細(xì)胞系生產(chǎn)生物制品的規(guī)程》《人用鼠源性單克隆抗體質(zhì)量控制要點(diǎn)》《預(yù)防用新生物制品臨床研究的技術(shù)要求》《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》《人的體細(xì)胞治療申報(bào)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則》《人基因治療申報(bào)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則》《藥理毒理檢查指導(dǎo)原則》《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理辦法》《藥品注冊(cè)管理辦法》第15頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)：1、來(lái)源：活的生物體（細(xì)菌或細(xì)胞）；2、結(jié)構(gòu)：復(fù)雜（包括組成、空間結(jié)構(gòu)）；3、生產(chǎn)：涉及生物材料和生物學(xué)過(guò)程（發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化等），有其固有的易變性。第16頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面：1、生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制GMP（硬件、軟件）2、最終目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制（方法學(xué)研究）第17頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三質(zhì)量控制方法學(xué)研究具體內(nèi)容一、生物學(xué)活性測(cè)定和比活性二、蛋白質(zhì)純度檢查三、蛋白質(zhì)含量測(cè)定四、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定五、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析六、對(duì)糖蛋白的特殊要求七、殘余雜質(zhì)檢查八、安全性及其他檢測(cè)項(xiàng)目九、生物技術(shù)藥物待測(cè)樣品保存第18頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、生物學(xué)活性測(cè)定和比活性

1、意義：1）基因工程產(chǎn)品的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)、多肽，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)所形成的活性中心所決定的，與其絕對(duì)質(zhì)量不一致。2）基因工程產(chǎn)品的生物學(xué)活性與藥效學(xué)基本相一致。3）利用生物學(xué)活性建立的測(cè)定效價(jià)體系，是給藥品定量的依據(jù)，保證產(chǎn)品藥效的重要手段。第19頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三效價(jià)測(cè)定一般原則1、國(guó)際通用方法；2、測(cè)定結(jié)果須用國(guó)際或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校正，以國(guó)際單位表示。第20頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物學(xué)活性測(cè)定方法分類1）體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法

a、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用（G-CSF:NFS-60）

b、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用(TNF:L929)

c、間接保護(hù)細(xì)胞作用(IFN:VISH;VSV)2）離體動(dòng)物器官測(cè)定法采用家兔主動(dòng)脈條測(cè)定重組腦利鈉肽生物活性。3）體內(nèi)測(cè)定法4）生化酶促反應(yīng)測(cè)定法5）免疫學(xué)活性測(cè)定法第21頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三取兔離體動(dòng)脈條剪成約1.5cm長(zhǎng)、2～3mm寬的螺旋環(huán)，懸掛于含10mL通氧的37℃臺(tái)氏液(取NaC18.0g、KC10.2g、CaCl20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g、NaHCO31.0g、Glucose1.0g用蒸餾水配成1000mL的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH至7.4)的麥?zhǔn)显〔壑?，加?fù)荷1g，穩(wěn)定1h，期間每20min換1次臺(tái)氏液：連接多導(dǎo)記錄儀，調(diào)節(jié)靈敏度，記錄血管的張力變化。第22頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三待張力曲線基線穩(wěn)定后，加入1.25mg·mL-1鹽酸去氧腎上腺素溶液0.05mL于麥?zhǔn)显〔壑惺蛊浣K濃度為6.25×10-5mg·mL-1

，曲線升高至最高并穩(wěn)定后，開(kāi)始按累計(jì)濃度給藥法(曲線穩(wěn)定后對(duì)倍增加樣品濃度為：6.25×10-5～8.0×10-2RU·mL)加入重組人腦利鈉肽對(duì)照品，記錄血管的張力變化。完成上述給藥后，洗脫并穩(wěn)定1h，期問(wèn)每20min換1次臺(tái)氏液。待基線穩(wěn)定后，按測(cè)定對(duì)照品的方法測(cè)定待測(cè)樣品，記錄測(cè)定結(jié)果。計(jì)算對(duì)照品和各實(shí)驗(yàn)樣品的半效稀釋倍數(shù)，按下式計(jì)算樣品效價(jià)：樣品效價(jià)=對(duì)照品效價(jià)×樣品半效稀釋倍數(shù)／對(duì)照品半效稀釋倍數(shù)第23頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

利用動(dòng)物體內(nèi)某些指標(biāo)變化，定出產(chǎn)品的單位，如EPO活性測(cè)定，體內(nèi)注射EPO后，計(jì)算小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞增加的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定其活性單位。第24頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

基于產(chǎn)品與某種物質(zhì)的結(jié)合或產(chǎn)品本身的化學(xué)反應(yīng)為原理設(shè)計(jì)，具有簡(jiǎn)便、精確、穩(wěn)定等特點(diǎn)，如重組鏈激酶、葡激酶生物活性測(cè)定，鏈激酶、葡激酶和纖溶酶原（h-plg）結(jié)合形成復(fù)合物激活游離h-plg原為有活性的纖溶酶。第25頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

利用制品免疫原性，制備相應(yīng)單克隆抗體或多克隆抗體，采取ELISA法測(cè)定其含量。第26頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物學(xué)活性測(cè)定方法選擇體內(nèi)測(cè)定和體外測(cè)定方法

a、體內(nèi)測(cè)定：即整體動(dòng)物測(cè)定，能為較大范圍的重組產(chǎn)品的效價(jià)提供有用信息，但費(fèi)時(shí)、昂貴、難操作及同時(shí)存在倫理問(wèn)題，大多數(shù)情況下傾向于選擇體外測(cè)定方法。

b、體外測(cè)定：可使用分離的器官或組織、原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系，目前最常用方法是連續(xù)生長(zhǎng)、因子依賴的、克隆化的細(xì)胞系的方法，其測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)、容易使用和便于統(tǒng)計(jì)分析。第27頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物學(xué)活性測(cè)定方法選擇2、定量、半定量、定性方法

a、通過(guò)研究首先選擇能夠定量評(píng)價(jià)的方法，最好的選擇是背景較低的反應(yīng)，并且對(duì)相關(guān)產(chǎn)品有陡峭的、可重復(fù)的劑量-反應(yīng)曲線；其次考慮半定量方法（如NGF），最后考慮定性（如BMP）方法。

b、對(duì)生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，生物學(xué)活性測(cè)定方法復(fù)雜，可采用其他替代方法（如重組人生長(zhǎng)激素用HPLC定量方法代替復(fù)雜生物活性測(cè)定方法）。第28頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞培養(yǎng)法中細(xì)胞染色標(biāo)記方法

3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖細(xì)胞數(shù)的比例的。BrdU：首先用BrdU做標(biāo)記，固定細(xì)胞，用核苷酸酶處理后使過(guò)氧化物酶結(jié)合抗BrdU抗體發(fā)生反應(yīng)。MTT（四氮唑鹽）：其在活細(xì)胞的線粒體中可以定量地被琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物MTTformazan,二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色結(jié)晶物，通過(guò)比色法測(cè)定MTTformazan的量可以反映線粒體電子傳遞系統(tǒng)機(jī)能，間接表示細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。第29頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活細(xì)胞中的線粒體酶還原，還原后染料（570nm）發(fā)生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比，可用分光光度計(jì)或熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。

Crystalviolet：染活細(xì)胞后，在比色計(jì)中測(cè)定光吸收值（A），A值與著染色細(xì)胞數(shù)成正比。第30頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

幾種細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定方法比較

3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系統(tǒng) 線粒體電子傳遞系統(tǒng)

檢出細(xì)胞的狀態(tài)增殖 增殖、生存檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、熒光抽出的必要性 + ++- 其他試劑的必要性+ ++ +- 成本（以MTT為1時(shí)） 6080-100（試劑盒）1 2缺點(diǎn) 使用同位素 不適合檢出大量未增殖檢出未增浮游細(xì)胞細(xì)胞，處理時(shí)費(fèi)力殖活細(xì)胞

第31頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物學(xué)活性測(cè)定分析方法

1、用能誘導(dǎo)50%最大反應(yīng)的待測(cè)樣品最高稀釋度作為參考效價(jià)（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為1單位，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測(cè)樣品所含的單位數(shù)。

2、比較已知濃度或活性單位樣品標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?；钚詷?biāo)準(zhǔn)品待測(cè)樣品稀釋度abA值生物學(xué)測(cè)定基本模式圖第32頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)藥物的比活性測(cè)定的意義1、比活性：每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性單位。2、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不能常規(guī)測(cè)定，而它的改變（如二硫鍵的錯(cuò)誤配對(duì)）可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。3、比活性可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定情況，可比較不同表達(dá)體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時(shí)的質(zhì)量情況。4、比活性是重組蛋白質(zhì)藥物不同于化學(xué)藥的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是進(jìn)行成品分裝的重要定量依據(jù)。第33頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)范圍確定1、使用驗(yàn)證過(guò)的測(cè)定和分析方法，并提供用此方法的效價(jià)測(cè)定平均值和單測(cè)定一批誤差的可信限范圍。2、對(duì)于成品的生物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，要根據(jù)不同方法的特點(diǎn)規(guī)定相當(dāng)標(biāo)示量的范圍，目前，生物活性的測(cè)定方法有四類：動(dòng)物基礎(chǔ)、細(xì)胞基礎(chǔ)、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結(jié)合法。第34頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三不同生物活性測(cè)定方法的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)表測(cè)定方法規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物基礎(chǔ)的生物活性測(cè)定70%～130%標(biāo)示量細(xì)胞基礎(chǔ)的生物活性測(cè)定80%～120%標(biāo)示量體外酶法的生物活性測(cè)定85%～115%標(biāo)示量受體結(jié)合的生物活性測(cè)定85%～115%標(biāo)示量第35頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物學(xué)活性效價(jià)測(cè)定過(guò)程中

標(biāo)準(zhǔn)品的作用1、生物學(xué)活性測(cè)定變異范圍大，同樣制品在不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果差異很大，必須有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。2、標(biāo)準(zhǔn)品的使用，最大限度地減少實(shí)驗(yàn)室之間和各種影響測(cè)定因素地干擾。第36頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、蛋白質(zhì)純度檢查1、蛋白質(zhì)純度檢查是重組蛋白質(zhì)藥物地重要指標(biāo)之一。2、按WHO規(guī)定必須用HPLC和非還原SDS兩種方法測(cè)定，其純度都應(yīng)達(dá)到95%以上，有的甚至要求達(dá)到99%以上。3、純度的檢查通常是在原液中進(jìn)行。4、方法：非還原SDS電泳法、HPLC法、毛細(xì)管電泳。第37頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三非還原SDS電泳法：

1、銀染加樣量≥5ug（1～10ng）

2、考馬斯亮藍(lán)R-250

加樣量≥10ug（100ng）結(jié)果：無(wú)明顯雜蛋白帶出現(xiàn)；目標(biāo)蛋白量應(yīng)不低于總蛋白量的95%或98%。蛋白質(zhì)樣品在荷質(zhì)比均一。第38頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與SDS原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。毛細(xì)管電泳：簡(jiǎn)便、快速、靈敏度和分辨率高；價(jià)格高、重現(xiàn)性差。第39頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

幾種檢定重組蛋白純度方法的比較特性HPLCSDS、IEFCE分離機(jī)制極性、非極性分配，電荷、等電點(diǎn)電荷等分子大小、離子交換分析所需時(shí)間10～120min幾小時(shí)10～30min

分辨力好好好樣品體積10～50ul1～50ul1～50nl靈敏度范圍ng～ugng～ugpg定量準(zhǔn)確性+±+分析方式紫外、熒光、折射紫外（可見(jiàn)、熒光）同HPLC

電化學(xué)、放射性銀染、放射自顯影儀器價(jià)格中～高低中～高日常消耗低高低自動(dòng)化中～高低中～高人力操作低高低制備級(jí)中中微量級(jí)制備收集樣品可以可以較困難第40頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

用于研究蛋白質(zhì)純度的方法和機(jī)制

方法分析機(jī)制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛細(xì)管電泳荷質(zhì)比離子交換HPLC電荷等電聚焦電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷比

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷，分子大小分子排阻HPLC分子大小質(zhì)譜測(cè)量法分子大小第41頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、蛋白質(zhì)含量測(cè)定1、此項(xiàng)目主要用于原液比活性計(jì)算和成品規(guī)格的控制。2、可根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。第42頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三靈敏范圍：5～100ug/ml；優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏度較高；不同蛋白質(zhì)間的變異少；缺點(diǎn)：受多種物質(zhì)干擾，反應(yīng)速度慢，某些試劑不穩(wěn)定。第43頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

Bradford法是采用考馬斯亮藍(lán)-G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、靈敏的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法；靈敏范圍：25～200ug/ul，需要時(shí)間：10min。第44頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三靈敏范圍：0.2～2mg/ml簡(jiǎn)單、省時(shí)受光吸收物質(zhì)影響蛋白濃度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260第45頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

蛋白質(zhì)常用的定量方法的比較方法所需蛋白質(zhì)破壞蛋白質(zhì)/蛋白技術(shù)方法的變異的量（mg/ml）與否質(zhì)變化情況復(fù)雜性系數(shù)（%）雙縮脲0.5～5是少簡(jiǎn)單、快速5Lowry0.05～5是中等顯色慢、試劑多5凱氏定氮0.05～3是少干擾、復(fù)雜、慢0.154紫外吸收法0.05～2否大簡(jiǎn)單、快速、0.439（280nm）干擾物質(zhì)多染料結(jié)合法0.01～0.05是中等簡(jiǎn)單、快速3.75熒光法0.001～0.01否中等較易3.75第46頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定特異性鑒別試驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定等電點(diǎn)測(cè)定肽圖分析吸收光譜氨基酸組成分析N末端和C末端氨基酸測(cè)序第47頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三特異性鑒別試驗(yàn)主要確定蛋白質(zhì)的抗原性免疫學(xué)方法（免疫印跡、斑點(diǎn)免疫、免疫電泳、免疫擴(kuò)散）：根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)建立的方法?？贵w中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鑒別試驗(yàn)，該方法簡(jiǎn)便易行、要求抗體必須為中和抗體。第48頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定還原型SDS：蛋白質(zhì)在SDS和β-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負(fù)電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過(guò)程中蛋白遷移率基本只與其相對(duì)分子質(zhì)量相關(guān)。凝膠過(guò)濾（分子篩）法：根據(jù)蛋白分子大小和性狀進(jìn)行測(cè)定。第49頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三等電點(diǎn)測(cè)定重組蛋白質(zhì)藥物的等電點(diǎn)往往是不均一的，但在生產(chǎn)過(guò)程中批與批之間的電泳結(jié)果應(yīng)一致，以說(shuō)明其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。方法：等電聚焦電泳法(IEF)

毛細(xì)管電泳法。第50頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三肽圖分析肽圖分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)做精密比較的手段。蛋白質(zhì)一般經(jīng)化學(xué)裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、SDS電泳法、質(zhì)譜法測(cè)定。同種產(chǎn)品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定性的驗(yàn)證指標(biāo)。第51頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三吸收光譜對(duì)某一重組蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，其最大吸收波長(zhǎng)是固定的。在生產(chǎn)工程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)一致。重組產(chǎn)品一級(jí)結(jié)構(gòu)不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測(cè)定。第52頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三氨基酸組成分析采用微量氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，包括蛋白質(zhì)水解，自動(dòng)進(jìn)樣、氨基酸分析、定量分析報(bào)告等。有柱前衍生法和柱后反應(yīng)法，前者是氨基酸先和熒光試劑作用生成衍生物，然后用色譜柱進(jìn)行分離，檢測(cè)氨基酸衍生物的熒光；后者是氨基酸先用色譜柱分離，再與茚三酮、熒胺等試劑顯色后進(jìn)行分析檢測(cè)。第53頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三N-末端和C-末端氨基酸測(cè)序作為重組蛋白質(zhì)和肽的重要鑒別指標(biāo)，一般要求至少測(cè)定N-末端15個(gè)氨基酸、C-末端1～3氨基酸。第54頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)，不但活性降低而且會(huì)引起抗原性增加。第55頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三六、對(duì)糖蛋白的特殊要求評(píng)價(jià)用生物技術(shù)方法生產(chǎn)的糖蛋白時(shí)，應(yīng)考慮糖基化位點(diǎn)的上調(diào)或下調(diào)及其對(duì)生物活性、代謝、穩(wěn)定性、溶解性的影響。每一種真核細(xì)胞具有其獨(dú)特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過(guò)基因工程方法將一種糖蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)，可以導(dǎo)致生產(chǎn)不同類型的糖蛋白，即使在相同的細(xì)胞類型中，也可能會(huì)出現(xiàn)糖形成時(shí)由于一些寡糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)不同等而產(chǎn)生截然不同的糖蛋白。第56頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三七、殘余雜質(zhì)檢測(cè)

1、對(duì)殘余雜質(zhì)進(jìn)行限制的意義

a、殘余雜質(zhì)可能具有毒性，引起安全性問(wèn)題；

b、可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質(zhì)；

c、反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。第57頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三殘余雜質(zhì)檢測(cè)

2、殘余雜質(zhì)分類

a、外來(lái)污染物：微生物、熱原、細(xì)胞成分（蛋白質(zhì)、DNA等）、培養(yǎng)基成分、純化步驟引入的成分（親和柱中的抗體、增溶用的SDS）等；

b、與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)：突變物、錯(cuò)誤裂解物，二硫化物異構(gòu)體、二聚體和多聚體；化學(xué)修飾形態(tài)（脫酰氨基或氧化形式、其他降解產(chǎn)物）第58頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三殘余雜質(zhì)檢測(cè)內(nèi)容宿主細(xì)胞蛋白含量宿主細(xì)胞DNA鼠源型IgG含量（10ng/劑量）蛋白A含量小牛血清殘留量殘余抗生素（氨芐西林）內(nèi)毒素含量（LAL）產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)其他雜質(zhì)（加入的離子、SDS、甲醛等）第59頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三宿主細(xì)胞蛋白含量以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點(diǎn)免疫。常采用5種最常用的E.coli菌株混和作為ELISA測(cè)菌體蛋白含量的通用標(biāo)準(zhǔn)。不同表達(dá)體系對(duì)菌體蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)不同。來(lái)自E.coli菌株的產(chǎn)品為不大于0.1%；來(lái)自CHO細(xì)胞的產(chǎn)品為不大于0.05%。第60頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三宿主細(xì)胞DNA測(cè)定方法：采用DNA雜交實(shí)驗(yàn)，用固相斑點(diǎn)雜交法，以地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒或者用同位素標(biāo)記DNA探針進(jìn)行測(cè)定，必須提供相應(yīng)宿主細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品?，F(xiàn)行生物制品規(guī)程對(duì)宿主細(xì)胞DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)作了相應(yīng)調(diào)整：由小于100pg/劑量調(diào)整為小于10ng/劑量。宿主細(xì)胞DNA只作為一種細(xì)胞污染因素不作為一種危險(xiǎn)因素。第61頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三 安全性及其他檢測(cè)項(xiàng)目無(wú)菌試驗(yàn)熱源試驗(yàn)異常毒性試驗(yàn)免疫原性檢查水分、裝量、pH檢測(cè)第62頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三生物技術(shù)藥物待測(cè)樣品保存

生物技術(shù)藥物大多為具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽，易受環(huán)境條件的影響。根據(jù)不同產(chǎn)品原液與成品、凍干與液體制劑的不同要求，可選擇在－20℃、－80℃、4℃和常溫條件下保存。冷凍保存的原液樣品最好分成小包裝保存，避免反復(fù)凍溶。第63頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三檢定方法的驗(yàn)證檢定方法的驗(yàn)證就是根據(jù)方法的需要測(cè)定該方法的專屬性、準(zhǔn)確性、精密性、直線性、測(cè)定范圍、測(cè)定限度、測(cè)量限度、特異性和耐用性（或可靠性）等幾個(gè)指標(biāo)中的一個(gè)或幾個(gè)。對(duì)于理化測(cè)定方法已有了確定的要求和判定標(biāo)準(zhǔn)，而生物學(xué)測(cè)定的結(jié)果具有更大的可變性，一般要使用動(dòng)物或細(xì)胞，這些有機(jī)體本身就具有較大的可變性，因此生物學(xué)測(cè)定的要求和合格標(biāo)準(zhǔn)要松一些。第64頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題首先要確定方法的適用性，該方法首先可以得到可重復(fù)的、可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要考慮在以下幾個(gè)參數(shù)：準(zhǔn)確性、精確性、靈敏性、特異性和耐用性（可靠性）。第二，要與已知的方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以考查二者間的相互關(guān)系。如果在該實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無(wú)可對(duì)比的老方法，則首先建立標(biāo)準(zhǔn)的方法，用含一定范圍濃度的樣品進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)方法所得結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法進(jìn)行對(duì)比處理，得出二種方法間的相關(guān)系數(shù)。對(duì)于一個(gè)新建立的方法則需要進(jìn)行協(xié)作研究對(duì)其適用性進(jìn)行驗(yàn)證。

第65頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三驗(yàn)證中需測(cè)定的參數(shù)1、專屬性/特異性（selectivity/specificity）是指當(dāng)檢測(cè)方法對(duì)測(cè)試樣品中含有制品中應(yīng)有的其他化合物時(shí)，測(cè)定待測(cè)物的能力。本參數(shù)用于鑒別試驗(yàn)、濃度或效力試驗(yàn)和純度試驗(yàn)的測(cè)定，以確定使用該檢測(cè)方法所測(cè)定的結(jié)果是否準(zhǔn)確地反映了制品的鑒別、效價(jià)或純度。特異性就象準(zhǔn)確性一樣，一般用偏差或測(cè)定值與已知值之間的錯(cuò)誤率（%）來(lái)表示。

第66頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

2、直線性（linearity）是測(cè)定結(jié)果與樣品中測(cè)試物濃度的線性關(guān)系，該參數(shù)的測(cè)定將確定檢測(cè)方法的測(cè)量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關(guān)系數(shù)R和測(cè)定系數(shù)R2

。

第67頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

3、測(cè)量范圍（Range）

是指當(dāng)準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時(shí)所能測(cè)得的樣品中待檢物的最高和最低濃度范圍，它就是測(cè)定直線性的上下限，如果劑量和反應(yīng)間的關(guān)系不成直線，測(cè)量范圍可以通過(guò)校正曲線來(lái)測(cè)得。在《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定測(cè)量范圍是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確性和直線性，測(cè)定方法適用的高低限度或量的區(qū)間。第68頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

4、準(zhǔn)確性（accuracy）表示測(cè)定值與真實(shí)值之間的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收試驗(yàn)來(lái)測(cè)定準(zhǔn)確性，即將已知量的樣品加到空白中進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定值與真實(shí)值之比。準(zhǔn)確性一般表示為偏差或測(cè)定值與真值之間的錯(cuò)誤率（回收率）（即測(cè)定值/真實(shí)值×100%）。一般對(duì)于生物制品而言，因?yàn)闆](méi)有純的標(biāo)準(zhǔn)品，所以準(zhǔn)確性不太實(shí)用。生物制品測(cè)定時(shí)一般與同時(shí)進(jìn)行的參考品進(jìn)行比較而得，此時(shí)的合格標(biāo)準(zhǔn)一般是測(cè)定出的參考品值的合格范圍或樣品與參考品之間的比值。第69頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

5、精密性（precision）表示測(cè)定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(shù)(CV%)，變異系數(shù)即是測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)差與測(cè)定值的比值。精密性分幾種：一種是實(shí)驗(yàn)內(nèi)的精密性（即重復(fù)性），它是在同一次試驗(yàn)內(nèi)同一個(gè)樣品多次測(cè)定結(jié)果間的變異系數(shù)。另一種是試驗(yàn)間的精密性，它是在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同次試驗(yàn)間對(duì)同一樣品多次測(cè)定結(jié)果間的變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)室之間的精密性即重現(xiàn)性一般可通過(guò)協(xié)作研究得到，此參數(shù)不適合生產(chǎn)設(shè)施的驗(yàn)證。第70頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

6、測(cè)定限度（LimitofDetection）是指能夠測(cè)定出的樣品中測(cè)試物的最低量。該量并不一定要定量測(cè)出其準(zhǔn)確的含量或濃度，LOD是檢查限度實(shí)驗(yàn)中最重要的一個(gè)參數(shù)。

第71頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

7、測(cè)量限度（LimitofQuantitation）

是指在準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時(shí)能夠定量測(cè)定出的樣品中測(cè)試物的最低量。LOQ是檢查測(cè)定藥品中不純物方法的一個(gè)參數(shù)。第72頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三

8、耐用性（robustness/ruggedness）是通過(guò)有效地改變實(shí)驗(yàn)方法的參數(shù)，來(lái)測(cè)定此改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受影響的承受程度。參數(shù)的改變可以是室溫或培養(yǎng)溫度，或濕度、或改變培養(yǎng)時(shí)間，或?qū)υ噭┑膒H進(jìn)行較小范圍的調(diào)整等。在每種試驗(yàn)條件下，對(duì)準(zhǔn)確性、精密性、或其他參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，以確定試驗(yàn)方法的耐受或承受能力。第73頁(yè)，講稿共81頁(yè)，2023年5月2日，星期三不同測(cè)定方法應(yīng)進(jìn)行的驗(yàn)證的參數(shù)參數(shù)鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查效價(jià)測(cè)定組成測(cè)定定量限度準(zhǔn)確性

+