痰抗酸桿菌的熒光染色法

關(guān)于痰抗酸桿菌的熒光染色法第1頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌的熒光染色檢查法主要內(nèi)容1.原理2.操作程序3.舜宇EX30熒光顯微鏡的操作使用4.質(zhì)量控制第2頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色的原理抗酸桿菌是無色半透明的有陰電荷和很微弱的固有熒光的微生物，而熒光素金胺O是一種含有自由氨基的金黃色堿性染料，它的離子帶有陽電荷，因此金胺O能和帶陰電荷的抗酸桿菌結(jié)合而使其著熒光色素，當(dāng)其遇到紫外線或青色線時，即可激發(fā)出桔黃色熒光。第3頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（一）涂片①取經(jīng)95%乙醇擦拭脫脂過的干燥、清潔、無油污、無劃痕的新玻片，于玻片磨砂端用鉛筆在背面左端1/3標(biāo)注實(shí)驗(yàn)編號和序號；②在生物安全柜內(nèi)，小心打開標(biāo)本容器，用折斷的竹簽（需事先準(zhǔn)備好）茬端挑取痰標(biāo)本的膿樣、干酪樣部分，于玻片右側(cè)2/3處均勻涂抹成10×20mm卵圓形痰膜，待自然干燥。第4頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色1．把痰片放在染色架上，痰片間距應(yīng)大于10mm，火焰固定(5秒鐘火焰在玻片下方通過4次)；2.滴加0.1%金胺Ｏ染液，蓋滿痰膜，保持染色15分鐘。染色時應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液。第5頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色3．流水自玻片上端輕緩沖洗，洗去染色液后傾斜玻片瀝去殘余水；4．滴加脫色液（3%鹽酸乙醇），脫色3分鐘或至痰膜無色；5.流水自玻片上端輕洗，如果脫色不徹底，重復(fù)脫色操作；第6頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色6．瀝去殘余水；7．滴加0.5%高錳酸鉀復(fù)染液，保持染色1～4分鐘（根據(jù)試劑說明書或經(jīng)驗(yàn)）；流水自玻片上端輕洗，洗去復(fù)染液，瀝去殘余水，待自然干燥。第7頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報告使用汞光源燈或LED光源的熒光顯微鏡，用10×目鏡，20×物鏡觀察，發(fā)現(xiàn)疑似抗酸菌的桿狀物，轉(zhuǎn)用40×物鏡確認(rèn)。在黑暗背景下，抗酸桿菌呈黃色綠熒光，桿狀略彎曲。按下列標(biāo)準(zhǔn)報告結(jié)果：1.抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察50個視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。第8頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報告2.抗酸桿菌（1~9條）：1～9條抗酸桿菌/50個視野（報告抗酸桿菌數(shù)）。3.抗酸桿菌陽性（1＋）：10～49條抗酸桿菌/50個視野。4.抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野。第9頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報告5.抗酸桿菌陽性（3＋）：10～99條抗酸桿菌/每視野。6.抗酸桿菌陽性（4＋）：≥100條抗酸桿菌/每視野。鏡檢結(jié)果應(yīng)及時記錄在“結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室登記本”和檢驗(yàn)報告單上。第10頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（四）痰片保存熒光染色的痰涂片，在存放過程中抗酸桿菌的熒光會隨時間的延長而衰減，因此，熒光染色的標(biāo)本片必須盡快放置到避光環(huán)境、4℃冰箱保存，一般可保存半年。注意:熒光染色的痰涂片必須避光低溫存放，否則陽性標(biāo)本因熒光衰退，可導(dǎo)致抽查復(fù)檢時呈假陰性!第11頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三舜宇EX30顯微鏡熒光鏡操作簡要程序1.接通電源之前，確認(rèn)熒光器組的調(diào)光手輪是斷開（OFF）狀態(tài)；2.把外接電源變壓器輸出接口（直流6V）插入LED熒光照明器組的電源插口，然后把另一端直接插到供電插座上；3.緩緩順時針方向開啟熒光器組件的調(diào)光手輪，不必開到最大；4.將熒光濾光塊箭頭切換到指向Flourescence標(biāo)志第12頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三舜宇EX30顯微鏡熒光鏡操作簡要程序5.把熒光染色并已干燥的痰片裝入載物臺，目鏡10×配合物鏡20×尋找熒光物，在黑暗背景中尋找到熒光鏡象，發(fā)現(xiàn)形似抗酸桿菌的熒光物時，轉(zhuǎn)用40×物鏡確認(rèn)。6.鏡檢完畢，逆時針方向旋轉(zhuǎn)熒光器組件的調(diào)光手輪至關(guān)斷（OFF）位置，最后關(guān)斷電源插座開關(guān)或撥出顯微鏡變壓器供電端的插頭。(鏡檢后的標(biāo)本置于標(biāo)本盒內(nèi)，放4℃冰箱避光保存)第13頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三

萋—尼氏法與熒光法的主要區(qū)別：

項(xiàng)目萋—尼氏染色法熒光染色法初染色堿性復(fù)紅熱染5分鐘（或冷染15分鐘）0.1%金胺Ｏ染液，不加熱染色15分鐘，脫色時間1分鐘（脫色不徹底可重復(fù)）3分鐘（脫色不徹底可重復(fù)）復(fù)染液亞甲蘭復(fù)染，30秒高錳酸鉀復(fù)染，1～4分鐘鏡檢普通顯微鏡，目鏡10×，油鏡100×熒光顯微鏡，目鏡10×，物鏡40×陰性報告300個視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌50個視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌報告抗酸桿菌數(shù)1~8條抗酸桿菌/300視野1~9條抗酸桿菌/50個視野抗酸桿菌陽性(1＋)3－9條抗酸桿菌/100視野10~49條抗酸桿菌/50個視野抗酸桿菌陽性(2＋)1－9條抗酸桿菌/10視野1~9條抗酸桿菌/每視野抗酸桿菌陽性(3＋)1－9條抗酸桿菌/每視野10~99條抗酸桿菌/每視野抗酸桿菌陽性(4＋)≥10條抗酸桿菌/每視野≥100條抗酸桿菌/每視野標(biāo)本片保存拭去鏡油后放玻片盒，室溫保溫玻片盒避光、4℃冰箱保存標(biāo)本片保存期長期半年內(nèi)第14頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制主要包括：標(biāo)本收集、試劑、涂片、染色操作、顯微鏡維護(hù)、鏡檢和結(jié)果登記及痰片的保存。1.標(biāo)本收集：用密封有蓋盒收集痰標(biāo)本，容器應(yīng)標(biāo)明病姓名、送檢日期及門診號。標(biāo)本性質(zhì)：應(yīng)為深咳痰液，痰性狀類別：膿樣痰、干酪樣痰、血性樣痰、膿性粘液痰和水樣痰。第15頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制2.試劑：染液外觀無沉淀、無懸浮物（金胺O非常穩(wěn)定，一般不產(chǎn)生沉淀），貯存環(huán)境避光通風(fēng)、避免高溫，每次使用后及時蓋緊，已開瓶的試劑的使用，一般控制在6個月內(nèi)用完或棄去。3.涂片：應(yīng)當(dāng)取痰的膿樣、干酪樣部分，于玻片右側(cè)2/3均勻涂成10×20mm痰膜，自然干燥，染色前固定。第16頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制4.染色：初染15分鐘要避免染液干燥，可續(xù)加染液；脫色符合要求，復(fù)染操作根據(jù)試劑說明書或經(jīng)驗(yàn)控制好時間，時間過長可導(dǎo)致熒光亮度消失。初染、脫色、復(fù)染的水洗后，都要瀝去玻片上的殘余水。5.顯微鏡維護(hù)：防塵、防潮、防震、避免陽光直射，按操作規(guī)范使用，定期清掃灰塵。為延長光源燈的使用壽命，一般不把光源調(diào)到最強(qiáng)，并且注意使用后及時關(guān)閉光源燈開關(guān)和變壓器電源。第17頁，講稿共19頁，2023年5月2日，星期三抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制6.鏡檢：鏡頭清晰，無霉菌，視野清晰，物鏡20×尋找黑暗