土壤稀釋涂布平板法

實(shí)驗(yàn)概要分離、純化及初步鑒定土壤中的拮抗植物病原菌的放線菌。實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物的''天然培養(yǎng)基”，也是最豐富的菌種資源庫，我們可以從中分離出眾多放線菌，尤其是可以從耕作土壤中篩選出拮抗植物病原菌的放線菌。以耕作有武運(yùn)粳和蘇滬香粳的土壤為樣品，應(yīng)用稀釋涂布平板法分離各種微生物。菌落計(jì)數(shù)后，通過菌落形態(tài)觀察并挑取放線菌進(jìn)行劃線分離純化，多次重復(fù)后得到單菌落。在進(jìn)行放線菌形態(tài)等初步鑒定后，將純化的菌株接入斜面?zhèn)鞔２?。最后，分離純化的放線菌，初步鑒定其拮抗性。拮抗植物病原菌的放線菌的分離純化在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、作物種植等方面都有著重要的意義。主要試劑培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基其他試劑：銀染液A液B液（細(xì)菌鞭毛染色）40%KOH5%a-萘酚（V.P.實(shí)驗(yàn)）主要設(shè)備培養(yǎng)皿試管錐型瓶接種環(huán)移液管震蕩器電爐載玻片超凈工作臺(tái)恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌鍋顯微鏡等實(shí)驗(yàn)材料土樣：蘇滬香粳1,2組楊稻6號(hào)93113,4組武運(yùn)粳5,6組實(shí)驗(yàn)步驟稀釋涂布平板法(SpreadPlateMethod)稀釋涂布平板法是一種將菌體按比例制備成若干個(gè)稀釋度，再分別經(jīng)涂棒涂布培養(yǎng)而進(jìn)行微生物分離純化的方法。倒平板；制備土壤稀釋溶液連續(xù)不斷稀釋，得到不同稀釋度的土壤溶液；涂布分別吸取三種稀釋度菌液，均勻涂于培養(yǎng)基表面；培養(yǎng)；劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)。平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。此法常用于某些成品檢定(如殺蟲菌劑)，生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計(jì)數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測(cè)定值常受各種因素的影響。荷測(cè)杵呂 i/io荷測(cè)杵呂 i/io|/1o：i/i ”讒】煩，injt Inn1ml-n)Lliullinl對(duì)每個(gè)平板上的菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算每克或每毫升土壤樣品中含有細(xì)菌、放線菌的數(shù)量。公式如下：菌體數(shù)量cfu/g(mL)土樣==同一稀釋度重復(fù)的菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù)3.平板劃線分離法(StreakPlateMethod)平板劃線分離培養(yǎng)法對(duì)混有多種菌的平皿，用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無板表面進(jìn)行平行劃線和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的菌種沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。倒平板；劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線，從而將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，形成單個(gè)菌落；挑菌落同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。插片顯微觀察法(放線菌)插片培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室觀察放線菌形態(tài)的一種基本方法，其步驟是：挑取青銅小單孢菌(Micromonosporachalcea)的少量孢子絲，將菌絲塊接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基的中間，然后，用小鑷子夾起一塊無菌的蓋玻片，以45度角的角度斜插入培養(yǎng)基中，不要插入培養(yǎng)基太深，讓菌絲爬上蓋玻片；于37°C下培養(yǎng)3?5天后，再用小鑲子將蓋玻片取出，顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和抱子絲的形狀。斜面?zhèn)鞔２胤ㄐ泵鎮(zhèn)鞔２胤ㄊ侵笇⒕N(細(xì)菌和酵母菌宜采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的抱子接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8C的冰箱中保藏。保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2-4個(gè)月，移種1次。酵母菌2個(gè)月，移種1次。細(xì)菌最好每月移種1次。此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。放線菌形態(tài)觀察放線菌菌落觀察放線菌的菌落質(zhì)地致密，表面呈緊密的絨狀，或堅(jiān)實(shí)、干燥而多皺。由于基內(nèi)菌絲長在培養(yǎng)基內(nèi)，所以菌落與培養(yǎng)基結(jié)合較緊，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。當(dāng)孢子絲形成大量孢子布滿菌落表面時(shí)，使菌落呈絮狀、粉末狀或顆粒狀，而與細(xì)菌菌落判然有別。此外，如用放