真核轉(zhuǎn)染穩(wěn)定篩選標(biāo)記及原理

關(guān)于真核轉(zhuǎn)染穩(wěn)定篩選標(biāo)記及原理第1頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三外源基因表達(dá)的三個概念

轉(zhuǎn)染通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞中。分類

轉(zhuǎn)導(dǎo)通過病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)化通過生化或者物理方法將目的基因?qū)朐思?xì)胞中。第2頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三常用的真核表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)第3頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)染方法第4頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三

理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高、細(xì)胞毒性很低，但準(zhǔn)備程序復(fù)雜，對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性很難普及。非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)中，以陽離子非脂性物質(zhì)為主的混合物配方轉(zhuǎn)染效率最高。該類轉(zhuǎn)染具有廣譜、細(xì)胞毒性小、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，且不受培養(yǎng)液中的血清和抗生素的干擾，比脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法更方便。第5頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)染后的表達(dá)1.瞬時表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，一部分轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄輸出mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。幾天內(nèi)大部分的質(zhì)粒都會被降解或傳代而稀釋。一周以后幾乎檢測不到。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不整合到染色體上，出現(xiàn)短暫的（24-96h）高水平表達(dá)，依賴于質(zhì)粒純度、濃度和轉(zhuǎn)染效率。第6頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三2.穩(wěn)定表達(dá)

轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上可以持續(xù)存在，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以長期表達(dá)。

整合的概率比較小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株需要篩選標(biāo)記共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)穩(wěn)定。需要長時間的抗性選擇培養(yǎng)。第7頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的選擇性標(biāo)記營養(yǎng)缺陷性酵母trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。顯性選擇標(biāo)記，用于野生型酵母菌的轉(zhuǎn)染。G418篩選。第8頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三哺乳動物細(xì)胞遺傳性標(biāo)記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（HGPRT）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)潮霉素抗性選擇系統(tǒng)第9頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞內(nèi)DNA的合成途徑細(xì)胞的DNA合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式1.主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA2.旁路途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下補(bǔ)救合成DNA。第10頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：TK編碼產(chǎn)物：胸苷激酶篩選藥物：HAT選擇法H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成T：胸苷；補(bǔ)救合成dTTP的原料作用機(jī)理：TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個關(guān)鍵酶第11頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸編碼產(chǎn)物：二氫葉酸還原酶（DHFR）篩選藥物：葉酸類似物——氨基喋呤或氨甲喋呤作用機(jī)理：dhfr—缺陷型細(xì)胞因不能合成核酸而死亡，而導(dǎo)入了外源基因的細(xì)胞成功存活，并且在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達(dá)蛋白。第12頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三

黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因選擇系統(tǒng)

遺傳標(biāo)記：XGPRT編碼產(chǎn)物：黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶篩選藥物：霉酚酸作用機(jī)理：XGPRT合成GMP。哺乳動物細(xì)胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細(xì)胞可通過IMP生成GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。將含XGPRT基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP中間體補(bǔ)救合成GMP，使DNA合成正常進(jìn)行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此來篩選陽性細(xì)胞。第13頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：APH編碼產(chǎn)物：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶篩選藥物：新霉素，即G418一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成作用機(jī)理：新霉素抗性基因編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418。適用于所有的真核細(xì)胞第14頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)遺傳標(biāo)記：CAT，大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選藥物：氯霉素作用機(jī)理：真核細(xì)胞缺乏CAT，將CAT作為報告基因與目的基因一起導(dǎo)入到真核細(xì)胞，可在加入氯霉素的培養(yǎng)基中選擇陽性細(xì)胞。常用于瞬時表達(dá)研究。第15頁，講稿共17頁，2023年5月2日