生物學第三章 抗體123

第三章抗體〔Ab〕

內容一、根本概念二、免疫球蛋白的分子結構三、免疫球蛋白的特點與功能四、抗體的生物學活性五、免疫球蛋白的免疫原性六、人工制備的抗體抗體〔antibody,Ab)：機體在抗原物質刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應抗原發(fā)生特異性結合反響的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應抗原特異性地結合，具有免疫功能。免疫球蛋白〔Immunoglobulin，Ig〕是將具有抗體活性以及與抗體相關的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)。一、根本概念因為最初有人用電泳證明血清中抗體活性在γ球蛋白局部，故曾把抗體統(tǒng)稱為兩種(γ)球蛋白。后來證明，抗體并不都在γ區(qū)；而且位于γ區(qū)的球蛋白，也不一定都具有抗體活性。1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門會議，將具有抗體活性以及與抗體相關的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥等患者血清中存在的異常免疫球蛋白以及“正常人〞天然存在的免疫球蛋白亞單位等。因而免疫球蛋白是結構及化學的概念，而抗體是生物學及功能的概念?？贵w和免疫球蛋白的關系:抗體都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗體活性。分泌型Ig(sIg)和膜型Ig(mIg)。二、免疫球蛋白的分子結構〔一〕免疫球蛋白的根本結構四肽鏈結構，鏈間二硫鍵連接;兩條重鏈〔H〕和兩條輕鏈〔L〕;氨基端和羧基端。(1)根據(jù)重鏈分類：根據(jù)重鏈靠近羧基末端氨基酸組成及排列順序不同，將重鏈分為五種：γ、α、μ、δ、ε根據(jù)重鏈組成不同，將Ig分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)根據(jù)輕鏈分型：κ、λ型

各類Ig都有κ、λ兩型輕鏈分子。

1.重鏈與輕鏈根據(jù)氨基酸排列順序的不同分為：可變區(qū)〔V區(qū)〕：氨基酸組成、排列順序變化較大恒定區(qū)〔C區(qū)〕：氨基酸數(shù)量、種類、排列順序及含糖量都比較穩(wěn)定鉸鏈區(qū)(hingeregion)：位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。

2.可變區(qū)與恒定區(qū)超變區(qū)〔HVR〕輕鏈：24-34、50-56、89-97重鏈：31-35、50-65、95-102框架區(qū)〔FR〕超變區(qū)決定簇互補區(qū)〔CDR〕Ig的抗原結合部位，該部位也稱為CDRIg的獨特型決定簇

位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。3.鉸鏈區(qū)4.J鏈和分泌片

J鏈是一條多肽鏈，富含半胱氨酸，由漿細胞合成，以二硫鍵的形式共價結合到Ig的重鏈上。分泌片：由黏膜上皮細胞合成和分泌，以非共價形式結合到二聚體上，保護IgA，使之不受環(huán)境中酶的破壞，并介導IgA的轉運?！捕趁庖咔虻鞍椎乃馄文竟系鞍酌?papain)水解IgG：得到兩個相同的Fab段和一個Fc段。

〔二〕免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一個具有雙價活性的F〔ab’〕2段和假設干個小分子多肽碎片〔pFc’〕?！踩趁庖咔虻鞍椎墓δ軈^(qū)Ig的H鏈、L鏈每隔110個氨基酸即由鏈內二硫鍵連接形成一個能行使特定功能的球性單位，稱為Ig的結構域或功能區(qū)〔domain〕。VH和VL:識別和結合抗原；CH和CL:同種異型的遺傳標志CH2:補體C1q結合位點，IgG可通過胎盤CH3/CH4:與多種細胞外表的FcR結合(免疫調理,I型超敏反響)各功能區(qū)的作用IgG多為單體，是唯一能通過胎盤的抗體，據(jù)重鏈〔鏈〕免疫原性，IgG分4個亞型?！惨弧矷gG三、五類免疫球蛋白的特性與功能

IgG1、IgG2和IgG3能通過經(jīng)典途徑激活補體；〔補體是存在于人或脊椎動物血清與組織液和細胞膜外表的一組被激活后具有酶活性的蛋白質,包含30多種成分,被稱為補體系統(tǒng)。〕血清含量最高75%～85%，是介導體液免疫的主要抗體；半衰期較長：16～24d；主要的作用：溶解靶細胞、促進吞噬、中和、溶解病毒、炎癥介質作用；參與II、III型超敏反響。IgG的特點

為五聚體，是分子量最大的Ig，稱巨球蛋白。IgM激活補體、結合抗原、免疫調理作用比IgG強。

天然血型抗體是IgM?！捕矷gMIgM是個體發(fā)育中最早產(chǎn)生的抗體，胚胎晚期已能合成，新生兒臍帶血中假設IgM水平升高，提示胎兒曾有宮內感染。IgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，半衰期短，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷。mIgM是B細胞抗原受體〔BCR〕的主要成分,也可參與II、III型超敏反響。IgM的特點mIgM是B細胞抗原受體〔BCR〕的主要成分,也可參與II、III型超敏反響(一型過敏反應：立即性過敏反應(immediatehypersensitivityreaction)。機制：體內原先曾接觸過敏原，且已經(jīng)對過敏原產(chǎn)生特異性抗體(IgE)。當再次接觸過敏原時，體內肥大細胞(mastcells)或嗜堿性粒細胞(Basophils)立即釋放組織胺(histamine),leukotrienes等引起過敏癥狀的物質。二型過敏反應：細胞毒性〔cytotoxic〕機制：體內內原先曾接觸過敏原，且已經(jīng)對過敏原產(chǎn)生特異性抗體(IgG或IgM)。具特異性的IgG或IgM抗體與細胞外表的過敏原結合，藉由活化補體或細胞毒性T細胞，破壞被過敏原所附著的細胞。三型過敏反應：透過免疫複合物活化補體(immunecomplex)機制：過敏原與體內的IgG或IgM形成免疫複合物，堆積在體內，引起補體被活化，造成組織的破壞。四型過敏反應：遲發(fā)型，細胞媒介(cell-mediated)機制：過敏原引起體內CD4+T細胞被活化，因而釋出細胞間素〔cytokine〕導致組織和器官受損，常於暴露過敏原24-72小時後發(fā)生。

)分為血清型和分泌型兩種。血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生，占免疫球蛋白的10%-15%,為單體。而分泌型IgA〔sIgA〕是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生，為雙體。sIgA主要存在于唾液、淚液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜外表的分泌液中。(三)IgAIgA的特點參與皮膚粘膜的局部抗感染作用；初乳中含有高濃度的sIgA----母乳喂養(yǎng)；通過替代途徑激活補體；參與Ⅲ型超敏反響。sIgA的合成和主要作用部位在黏膜很少分泌，在血清中含量極低，占血清總Ig的0.2%，在血清中含量為30ug/ml,不穩(wěn)定，易降解，IgD是B細胞的重要外表標志，mIgD的出現(xiàn)標志著B細胞成熟，對防止免疫耐受有一定作用。(四)IgD血清中含量很低，在血清中含量為0.3ug/ml,是一類親細胞抗體，可與肥大細胞、嗜堿性粒細胞上的高親和力Fcε受體FcεRⅠ〕〔γ、α、μ、δ、ε〕結合，引起Ⅰ型超敏反響，F(xiàn)cεRⅡ分布于巨噬細胞、B細胞、嗜酸粒細胞。(五)IgE四、免疫球蛋白的生物學活性

V區(qū)的功能:

Fab片段的生物學活性抗體結合抗原的活性由Fab所呈現(xiàn)，由VH和VL所組成的抗原結合部位，可結合抗原，是決定抗體分子特異性的部位。

C區(qū)的功能：

Fc片段的生物學活性：該片段無結合抗原活性，但與抗體分子的生物學活性有密切關系：1、選擇性地通過胎盤；2、與補體結合活化補體；3、決定Ig分子的親細胞性(即與帶Fc受體細胞的結合)；4、Ig通過粘膜進入外分泌液等都是Fc片段的功能。

補體結合位點位于CH2上；Fc受體結合位點在CH3上。

五、免疫球蛋白的免疫原性Ig是蛋白質，因此一種動物的Ig對另一種動物而言是良好的抗原。Ig抗原特異性：Fc片段是Ig分子中的重鏈恒定區(qū)，因此它是決定各類Ig抗原特異性的部位。用Ig免疫異種動物產(chǎn)生的抗抗體(第二抗體)，可與相應Ig發(fā)生抗原抗體反響。免疫球蛋白的不同結構區(qū)其免疫原性不同：同種型〔isotype〕：指在同一種動物所有個體的不同類型的Ig共同具有的抗原特異性，同種間不表現(xiàn)出抗原性，只是在異種動物之間才表現(xiàn)出抗原性。Ig的同種型抗原決定簇主要存在于重鏈C區(qū)。同種異型〔allotype〕：指Ig在同一種動物不同個體之間呈現(xiàn)出的抗原性。同種異型的抗原決定簇存在于IgG、IgA、IgE的重鏈C區(qū)和k型輕鏈的C區(qū)。同種異型是Ig穩(wěn)定的遺傳標志，可用于親子鑒定。獨特型〔idiotope〕：抗體分子的特異性是由Ig的重鏈和輕鏈可變區(qū)所決定的，因此體內針對不同抗原分子的抗體之間的差異表現(xiàn)在Ig分子的可變區(qū)，這種差異就決定了抗體分子在機體內具有抗原性，由抗體分子的可變區(qū)呈現(xiàn)的抗原性就稱為Ig的獨特型。

獨特位：獨特型由Ig可變區(qū)假設干個抗原決定簇所組成，它們被稱為獨特位。獨特型在異種、同種異體乃至同一個體內均可刺激產(chǎn)生相應的抗體，稱為抗獨特型抗體。同種型(isotype):同一物種內所有個體共同具有的Ig抗原特異性結構。同種型Ig的抗原決定簇存在于CH、CL據(jù)CH的不同，Ig分類、亞類據(jù)CL的不同，Ig分型、亞型同種異型〔allotype)：同一物種內不同個體間的Ig免疫原性的差異。獨特型〔idotype)：同一個體內不同B細胞克隆產(chǎn)生的Ig其超變區(qū)各自具備獨特的抗原決定簇結構。1、多克隆抗體：多個抗原決定基——機體——多種抗體的混合物。2、單克隆抗體〔monoclonalantibody,mAb〕：由一個B細胞分化增殖的子代細胞〔漿細胞〕產(chǎn)生的、針對某一特定抗原決定簇的高度特異性抗體。3、基因工程抗體：利用基因工程技術來制備的抗體分子稱為基因工程抗體，是分子水平的抗體。六、人工制備的抗體1、多克隆抗體(PcAb)采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質經(jīng)不同途徑進入動物體內，經(jīng)免疫后，別離出血清，由此獲得的抗血清即為多克隆抗體。細菌病毒抗原，均是由多種抗原成分組成，即使純蛋白質抗原分子也含有多種抗原表位，因此進入機體后可激活許多淋巴細胞克隆，機體可產(chǎn)生針對各種抗原成分或抗原表位的抗體，由此獲得的抗血清是一種多克隆的混合抗體，具有高度的異質性。一只小鼠能產(chǎn)生約107-108種不同抗體，人約109種。2、單克隆抗體(McAb)由一個B細胞分化增殖的子代細胞(漿細胞)產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

McAb的特點：McAb的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨特型的特異性、親和力、生物學性狀及分子結構均完全相同。McAb技術原理：用人工的方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細胞與同系骨髓瘤細胞融合，形成B細胞雜交瘤細胞，這種雜交瘤細胞既具有骨髓瘤細胞無限繁殖特性，又具有B細胞分泌特異性抗體的能力，由克隆化的B細胞雜交瘤所產(chǎn)生的抗體即為單克隆抗體?！捕矪細胞雜交瘤株建立與McAb生產(chǎn)技術根本過程：B細胞的制備、骨髓瘤細胞的制備---細胞融合---檢測抗體--雜交瘤細胞的克隆化---細胞株凍存或單克隆抗體的生產(chǎn)。單克隆抗體的問世，極大地推動了免疫學及其他生物科學的開展，并于1984年獲得諾貝爾獎。McAb優(yōu)點與多克隆抗體比較，McAb具有無可比較的優(yōu)越性，具有高特異性、高純度、均質性好、親和力不變、重復性強、效價高、本錢低、并可大量生產(chǎn)等優(yōu)點。

(1)B細胞的制備：可用提純的抗原免疫Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次間隔2-4周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾臟，制成103/ml的脾細胞懸液，即為親本的B細胞。

(2)骨髓瘤細胞的制備：用與免疫相同品系小鼠的骨髓瘤細胞，要求其本身不能分泌Ig，而且具有某種營養(yǎng)缺陷，可用SP2/0或NS-1，它們缺少次黃嘌呤--鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，不能在HAT培養(yǎng)基上生長。(3)飼養(yǎng)細胞的準備：常用小鼠巨噬細胞或胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞。(4)選擇培養(yǎng)基：常用HAT選擇培養(yǎng)基，H為次黃嘌呤，T為胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成DNA的原料；A是氨基喋呤，是細胞內源性合成DNA的阻斷劑。在該培養(yǎng)基中，末融合的骨髓瘤細胞不能生長，因它不能利用旁路途徑合成DNA，內源性的合成又受到氨基喋吟的阻斷；至于未融合的脾細胞那么在2周內自然死亡，所以只有融合的雜交瘤細胞才能在該培養(yǎng)基中生長。(5)細胞融合將脾細胞與骨髓瘤細胞按一定比例(一般3:1-5:1)混合，離心后棄上清液，然后緩慢參加融合劑50％聚乙二醇(PEG4000)，搖動試管。靜置90s，逐漸參加HAT培養(yǎng)基，分于加有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板孔中，置5％-10％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后更換一半HAT培養(yǎng)基，再5d后改用HT培養(yǎng)基，再經(jīng)5d后用完全DMEM培養(yǎng)基。

(6)檢測抗體雜交瘤細胞培養(yǎng)后，應用敏感的血清學方法檢測各孔中的抗體。視抗原性質的不同，可采用放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光抗體技術間接法等。通過檢測篩選