免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)

免疫細(xì)胞功能(gōngnéng)檢測(cè)技術(shù)第一頁，共四十三頁。整理課件一淋巴細(xì)胞的功能(gōngnéng)檢測(cè)

淋巴細(xì)胞功能(gōngnéng)測(cè)定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是間接了解淋巴細(xì)胞對(duì)抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對(duì)抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測(cè)定第二頁，共四十三頁。整理課件淋巴細(xì)胞T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行(zhíxíng)體液免疫功能）NK細(xì)胞（非特異性免疫作用）第三頁，共四十三頁。整理課件一、T細(xì)胞(xìbāo)功能的檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)T細(xì)胞分泌(fēnmì)功能測(cè)定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)第四頁，共四十三頁。整理課件（一）T淋巴細(xì)胞增殖(zēngzhí)試驗(yàn)1.原理(yuánlǐ)：淋巴細(xì)胞DNA合成(héchéng)分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松第五頁，共四十三頁。整理課件

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個(gè)有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第六頁，共四十三頁。整理課件2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細(xì)胞

ConA-------T細(xì)胞

PWM-------T、B細(xì)胞

LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原(kàngyuán)同種組織抗原

第七頁，共四十三頁。整理課件3.檢測(cè)(jiǎncè)方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細(xì)胞（4-6天）母細(xì)胞化同位素法：PHA淋巴細(xì)胞（54h）

DNA合成期+3HTdR摻入

收集細(xì)胞(xìbāo)

檢測(cè)β射線

測(cè)定(cèdìng)細(xì)胞內(nèi)的3H－TdR第八頁，共四十三頁。整理課件（1）形態(tài)學(xué)檢查法第九頁，共四十三頁。整理課件方法學(xué)評(píng)價(jià)(píngjià)：優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法(fāngfǎ)簡(jiǎn)便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。第十頁，共四十三頁。整理課件培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測(cè)量放射性（2）3H-TdR摻入法第十一頁，共四十三頁。整理課件優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)(tóngshí)還存在放射性核素污染問題。第十二頁，共四十三頁。整理課件培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測(cè)量放射性MTT測(cè)吸光度(guāngdù)(3)MTT比色法第十三頁，共四十三頁。整理課件(二)T細(xì)胞分泌功能(gōngnéng)測(cè)定

體外培養(yǎng)(péiyǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。

第十四頁，共四十三頁。整理課件（三）T細(xì)胞(xìbāo)介導(dǎo)的細(xì)胞(xìbāo)毒試驗(yàn)1.原理(yuánlǐ)：靶細(xì)胞抗原(kàngyuán)T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞第十五頁，共四十三頁。整理課件形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞計(jì)數(shù)殘留腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞2.方法(fāngfǎ)意義(yìyì)：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

第十六頁，共四十三頁。整理課件圖15-2T細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)示意圖第十七頁，共四十三頁。整理課件靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測(cè)量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)51Cr釋放(shìfàng)法第十八頁，共四十三頁。整理課件(四)體內(nèi)(tǐnèi)試驗(yàn)特異性抗原(kàngyuán)皮膚試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)第十九頁，共四十三頁。整理課件二、B細(xì)胞(xìbāo)功能檢測(cè)B細(xì)胞(xìbāo)增殖能力的試驗(yàn)溶血空斑試驗(yàn)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測(cè)體內(nèi)試驗(yàn)第二十頁，共四十三頁。整理課件(一)B細(xì)胞(xìbāo)增殖能力的試驗(yàn)抗IgM細(xì)菌(xìjūn)脂多糖SAC的SPA

B細(xì)胞(xìbāo)增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法第二十一頁，共四十三頁。整理課件(二)溶血(rónɡxuè)空斑試驗(yàn)1.原理(yuánlǐ)：第二十二頁，共四十三頁。整理課件2.方法學(xué)：經(jīng)典溶血(rónɡxuè)空斑形成試驗(yàn)被動(dòng)溶血空斑試驗(yàn)

第二十三頁，共四十三頁。整理課件3．臨床應(yīng)用(yìngyòng)與評(píng)價(jià)溶血(rónɡxuè)空斑試驗(yàn)主要用于測(cè)定藥物和手術(shù)等因素對(duì)體液免疫功能的影響評(píng)價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。

第二十四頁，共四十三頁。整理課件(三)

B細(xì)胞抗體(kàngtǐ)形成功能的檢測(cè)

——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法ELISPOT1.原理(yuánlǐ)：第二十五頁，共四十三頁。整理課件2．應(yīng)用(yìngyòng)與方法學(xué)評(píng)價(jià)：該方法既可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可檢測(cè)抗體分泌量。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)(yòudǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測(cè)組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。第二十六頁，共四十三頁。整理課件(四)體內(nèi)(tǐnèi)試驗(yàn)體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清(xuèqīng)，測(cè)定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價(jià)，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。第二十七頁，共四十三頁。整理課件染色(rǎnsè)計(jì)數(shù)離心(líxīn)取上清測(cè)LDH或AKP離心(líxīn)取沉淀測(cè)活細(xì)胞熒光測(cè)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法三、NK細(xì)胞活性測(cè)定靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:

K562細(xì)胞株第二十八頁，共四十三頁。整理課件二吞噬細(xì)胞(tūnshìxìbāo)功能檢測(cè)技術(shù)

按其形態(tài)大小分為(fēnwéi)兩類：大吞噬細(xì)胞—單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)小吞噬細(xì)胞—中性粒細(xì)胞第二十九頁，共四十三頁。整理課件一、中性(zhōngxìng)粒細(xì)胞功能的檢測(cè)

細(xì)胞趨化功能的檢測(cè)吞噬(tūnshì)和殺菌功能的檢測(cè)第三十頁，共四十三頁。整理課件(一)細(xì)胞(xìbāo)運(yùn)動(dòng)功能——趨化功能檢測(cè)1.原理(yuánlǐ)：第三十一頁，共四十三頁。整理課件2.方法(fāngfǎ)：

瓊脂糖平板(píngbǎn)法

濾膜滲透法（Boyden小室法）第三十二頁，共四十三頁。整理課件(二)吞噬(tūnshì)和殺菌功能測(cè)定1．顯微鏡檢查法：第三十三頁，共四十三頁。整理課件2.溶菌法第三十四頁，共四十三頁。整理課件NBT還原(huányuán)試驗(yàn)

原理(yuánlǐ)：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲臜（紫黑色）3．NBT還原(huányuán)試驗(yàn)

第三十五頁，共四十三頁。整理課件中性(zhōngxìng)粒細(xì)胞NBT甲臜顆粒(kēlì)沉積于胞質(zhì)中第三十六頁，共四十三頁。整理課件二、巨噬細(xì)胞功能(gōngnéng)檢測(cè)(一)炭粒廓清(kuòqīng)試驗(yàn)

正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度(yìndù)墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。第三十七頁，共四十三頁。整理課件(二)吞噬(tūnshì)功能檢測(cè)

巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性抗原物質(zhì)(wùzhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。第三十八頁，共四十三頁。整理課件(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測(cè)定(cèdìng)1．酸性磷酸酶的測(cè)定硝酸鉛法偶氮法2．非特異性酯酶的測(cè)定常用(chánɡyònɡ)α-萘醋酸法第三十九頁，共四十三頁。整理課件(四)細(xì)胞毒作用(zuòyòng)測(cè)定

用IFN-γ激活小鼠巨噬細(xì)胞，觀察其對(duì)125I-UdR標(biāo)記(biāojì)的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815的殺傷活性。第四十頁，共四十三頁。整理課件(五)巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定(cèdìng)

激活的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固(nínggù)，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaCl2混合液，加入經(jīng)粘附有單層巨噬細(xì)胞的試管中，移置37℃，即時(shí)記錄血漿凝固時(shí)間。第四十一頁，共四十三頁。整理課件Thanks！第四十二頁，共四十三頁。整理課件內(nèi)容(nèiróng)總結(jié)免疫細(xì)胞