基因定點突變技術(shù)

基因定點突變技術(shù)基因定點突變技術(shù)定點突變定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段?；蚨c突變技術(shù)定點突變的目的基因定點的突變是指按照設(shè)計的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換和重排等變異。體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的有力工具。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，對某個已知基因的特定堿基進行定點改變，缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性?；蚨c突變技術(shù)基因定點突變技術(shù)寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變寡聚核苷酸定點誘變技術(shù)是由加拿大的生物化學(xué)家(michaelsmith)發(fā)明的.基因定點突變技術(shù)寡核苷酸定點突變基本原理合成一段寡聚脫氧核糖核苷酸作為引物，使其與帶有目的基因完全互補。合成的寡核苷酸引物除短的錯配區(qū)外，與目的基因完全互補。然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成單鏈DNA的復(fù)制。由此產(chǎn)生的雙鏈DNA，一條鏈為野生型親代鏈，另一條為突變型子代鏈。將獲得的雙聯(lián)分子通過轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞，并篩選出突變體其中基因已被定向修改基因定點突變技術(shù)基因定點突變技術(shù)盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)—盒式突變。盒式突變：用一段人工合成具有突變序列的DNA片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。然而，并非所有變異區(qū)附近都能找到合適的限制位點，如果不存在限制位點，就要用寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變引入限制位點?；蚨c突變技術(shù)基因定點突變技術(shù)PCR介導(dǎo)的定點突變在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物帶有錯配堿基便可使PCR產(chǎn)物的末端引入突變。但是誘變部分并不總在DNA的中間部分進行誘變。目前采用重組PCR進行定位誘變，可以在DNA片段的任意部位產(chǎn)生定位突變?；蚨c突變技術(shù)重疊延伸的介導(dǎo)的突變基因定點突變技術(shù)大引物誘導(dǎo)法基因定點突變技術(shù)定位突變用途定點突變法的應(yīng)用不僅廣泛用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，還可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)學(xué)矯正遺傳病、治療癌癥等病。定點突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性，改造啟動子或者DNA作用元件，引入新的酶切位點，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面?；蚨c突變技術(shù)應(yīng)用前景不同于定點突變的是基于PCR的隨機突變，通過改變PCR條件提高PCR過程中的隨機出錯，這種方法適用于未知的蛋白質(zhì)，作全局性分析，所以有人稱為飽和突變（saturationmutagenesis）。不過這種方法由于沒有目的性，分析操作相當繁瑣，并且不會出現(xiàn)一個位點2個以上堿基突變，因而應(yīng)用上有局限性。定點突變適用于蛋白結(jié)構(gòu)已有初步了解的基因，比PCR隨機突變更有目的性，也更為精確，簡單，同時改造基因更加“隨心所欲”。由于定點突變技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中有這非常廣泛的應(yīng)用前景，相信這個技術(shù)在不遠的將來還會有更大的改進和發(fā)展，也必將為更多人熟悉應(yīng)用。基因定點突變技術(shù)在分子生物學(xué)和基因工程中的應(yīng)用探明未知序列的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，如啟動子誘變篩選，真核的TATA盒保守序列確定。載體構(gòu)建：調(diào)控元件，強啟動子，多接頭。研究基因調(diào)控序列，如AUG前加入ACC序列最佳?；蚨c突變技術(shù)在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用降低毒性，如TNF改變亞型和種的特異性，如IFN的23位AAG（賴氨酸），AGG（精氨酸），使IFN2a變成IFN2b。123位Try（酪）變甘/絲，使IFN種屬特異性明顯改變，對人抗病毒活性小于牛。提高活性和穩(wěn)定性，如IFN-βser17（cys