小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersiniaenterocoli的i檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食源性疾病樣品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢驗(yàn)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.4食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)3設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)無菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：冰箱：2°C?5°C。恒溫培養(yǎng)箱：26C±lC、36C±lC。顯微鏡：10X?100X。3.4均質(zhì)器或滅菌乳缽。天平：感量0.1g。滅菌試管：16mmx160mm、15mmx100mm。滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。滅菌錐形瓶：200mL、500mL。3.9滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀，如VITEK。4培養(yǎng)基和試劑4.1改良磷酸鹽緩沖液：見第A.1章。4.2CIN-1培養(yǎng)基：見第A.2章。4.3改良Y培養(yǎng)基：見第A.3章。4.4改良克氏雙糖培養(yǎng)基：見第A.4章。4.5糖發(fā)酵管：見第A.5章。4.6鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見第A.6章。4.7半固體瓊脂：見第A.7章。4.8緩沖葡萄糖蛋白胨水［甲基紅（MR）和V—P試驗(yàn)用］：見第A.8章。4.9堿處理液：見第A.9章。4.10尿素培養(yǎng)基：見第A.10章。4.11API20E生化鑒定試劑盒或VITEKGNI+生化鑒定卡。

5檢驗(yàn)程序小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)程序見圖1。圖1小腸結(jié)腸炎耶爾森氏茵檢驗(yàn)程序6操作步驟6.1增菌以無菌操作稱取25g（或25mL）樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，以8000r/min均質(zhì)lmin或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min。液體樣品或粉末狀樣品，應(yīng)振蕩混勻。于26°C±l°C增菌48h?72h。6.2堿處理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合l5s。6.3分離將乳及其制品增菌液或經(jīng)過堿處理的其他食品增菌液分別接種CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板，于26°C±l°C培養(yǎng)48h±2h,典型菌落在CIN-1瓊脂平板上為紅色牛眼狀菌落，在改良Y瓊脂平板上為無色透明、不粘稠的菌落。6.4改良克氏雙糖試驗(yàn)分別挑取上述可疑菌落3個(gè)?5個(gè)，接種改良克氏雙糖斜面，于26C±lC培養(yǎng)24h,將斜面和底部皆變黃不產(chǎn)氣者做進(jìn)一步的生化鑒定。6.5尿素酶試驗(yàn)和動(dòng)力觀察將改良克氏雙糖上的可疑培養(yǎng)物接種到尿素培養(yǎng)基上，注意接種量要大，挑取一接種環(huán)，振搖幾秒鐘，于26C土1C培養(yǎng)2h?4h，然后將陽性者接種兩管半固體，分別于26C±lC和36C±1C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將26C有動(dòng)力的可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板，進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。6.6革蘭氏染色鏡檢小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌，有時(shí)呈橢圓或桿狀，大小為(0.8pm?3.0pm)x0.8pmo6.7生化鑒定6.7.1常規(guī)生化鑒定：從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落做生化試驗(yàn)，所有的生化反應(yīng)皆在26C±lC培養(yǎng)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的主要生化特性以及與其他菌的區(qū)別見表1o表1小腸結(jié)腸炎耶爾森氏茵與其他相似茵的生化性狀鑒別表項(xiàng)目小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌中間型耶爾森氏菌弗氏耶爾森氏菌克氏耶爾森氏菌假結(jié)核耶爾森氏菌鼠疫耶爾森氏菌動(dòng)力(26C)+++++-尿素酶+++++-VP試驗(yàn)(26C)+++---鳥氨酸脫羧酶++++--蔗糖d++---棉子糖-+---d山梨醇++++--甘露醇++++++鼠李糖-++--+注：+陽性；-陰性；d有不同生化型。6.7.2生化鑒定系統(tǒng)可選擇使用兩種生化鑒定系統(tǒng)(APl20E或VITEKGNI+)中任一種，代替常規(guī)的生化鑒定。API20E：從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，按照API20E操作手冊(cè)進(jìn)行并判讀結(jié)果。VITEK全自動(dòng)細(xì)菌生化分析儀：從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，按照VITEKGNI+操作手冊(cè)進(jìn)行并判定結(jié)果。6.8血清型鑒定除進(jìn)行生化鑒定外，可選擇做血清型鑒定。具體操作方法按GB/T4789.4中沙門氏菌0因子血清分型。7結(jié)果報(bào)告綜合以上生化特性報(bào)告結(jié)果，報(bào)告25g（或25mL）樣品中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。附錄A

(規(guī)范性附錄)

培養(yǎng)基和試劑A.1改良磷酸鹽緩沖液A.1.1成分磷酸氫二鈉8.23g磷酸二氫鈉1.2gTOC\o"1-5"\h\z氯化鈉 5.0g三號(hào)膽鹽 1.5g山梨醇 20gA.1.2制法將磷酸鹽及氯化鈉溶于蒸餾水中，再加入三號(hào)膽鹽及山梨醇，溶解后校正pH為7.6,分裝試管，于121°C高壓滅菌15min,備用。A.2CIN-1培養(yǎng)基A.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基：TOC\o"1-5"\h\z胰胨 20.0g酵母浸膏 2.0g甘露醇 20.0g氯化鈉 1.0g去氧膽酸鈉2.0g硫酸鎂 0.01g瓊脂 l2.0g蒸餾水 950mLpH7.5±0.1將基礎(chǔ)培養(yǎng)基于121C高壓滅菌15min,備用。A.2.2Irgasan:以95%的乙醇作溶劑，溶解二苯醚，配成0.4%的溶液，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷至80C時(shí)，加入1mL混勻。A.2.3冷至50C時(shí)，加入：中性紅(3mg/mL)10.0mL結(jié)晶紫(0.1mg/mL) 10.0mL頭孢菌素(1.5mg/mL)10.0mL新生霉素(0.25mg/mL)10.0mL最后不斷攪拌加入l0.0mL的10%氯化鍶，傾注平皿。A.3改良Y培養(yǎng)基A.3.1成分TOC\o"1-5"\h\z蛋白胨 15.0g氯化鈉 5.0g乳糖l0.0g草酸鈉 2.0g去氧膽酸鈉 6.0g三號(hào)膽鹽 5.0g丙酮酸鈉 2.0g孟加拉紅 40mg水解酪蛋白5.0g瓊脂 17g蒸餾水 1000ml.A.3.2制法將上述成分混合，校正pH7.4±0.1。于121^高壓滅菌15min,待冷至45°C左右時(shí)，傾注平皿。A.4改良克氏雙糖培養(yǎng)基A.4.1成分TOC\o"1-5"\h\z蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g山梨醇 20g葡萄糖 1g氯化鈉 5g檸檬酸鐵銨0.5g硫代硫酸鈉0.5g瓊脂 12g酚紅0.025g蒸餾水1000mlpH7.4A.4.2制法將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正？氏加入0.o2%的酚ETJ（溶液12.5mL,搖勻，分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層°l21C高壓滅菌15rain，放置高層斜面?zhèn)溆谩.5糖發(fā)酵管A.5.1成分TOC\o"1-5"\h\z牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化鈉 3g磷酸氫二鈉 2g0.2%漠麝香草酚藍(lán)溶液 12mL蒸餾水1000mLpH7.4A.5.2制法A.5.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內(nèi)，121C高壓滅菌15min。A.5.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶l00mL，121C高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時(shí)高壓滅菌。將5mL糖溶液加入100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純，加熱后會(huì)自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。A.5.3試驗(yàn)方法從瓊脂斜面上挑取少量培養(yǎng)物接種于26°C±l°C培養(yǎng)，一般觀察2d?3d。遲緩反應(yīng)需觀察14d?30d。A,6鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基A.6.1成分蛋白胨 5g酵母浸膏3g葡萄糖 1g蒸餾水1000mL1.6%漠甲酚紫-乙醇溶液1mLL-鳥氨酸或DL-鳥氨酸0.5g/100mL或1g/100mLpH6.8A.6.2制法除鳥氨酸以外的成分加熱溶解后，分裝，每瓶100mL,分別加入鳥氨酸。L-鳥氨酸按0.5%加入，DL-鳥氨酸按1%加人。再校正pH至6.8。對(duì)照培養(yǎng)基不加鳥氨酸。分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL,上面滴加一層液體石蠟，115C高壓滅菌10min。A.6.3試驗(yàn)方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于26C±lC培養(yǎng)18h?24h，觀察結(jié)果。鳥氨酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對(duì)照管為黃色。A.7半固體瓊脂A.7.1成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂 0.35g?0.4g蒸餾水100mLpH7.4A.7.2制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分裝小試管，121C高壓滅菌15min，直立凝固備用。注：供動(dòng)力觀察、菌種保存、H抗原位相變異試驗(yàn)等用。A.8緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR和V—P試驗(yàn)用）A.8.1成分TOC\o"1-5"\h\z磷酸氫二鉀 5g多胨 7g葡萄糖 5g蒸餾水1000mLpH7.0A.8.2制法溶化后校正pH,分裝試管，每管1mL,121°C高壓滅菌15min。A.8.3甲基紅(MR)試驗(yàn)自瓊脂斜面挑取少量培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中，于26C±lC培養(yǎng)2d?5d,哈夫尼亞菌則應(yīng)在22C?25C培養(yǎng)。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色為陰性。甲基紅試劑配法：10mg甲基紅溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸餾水。A.8.4V-P試驗(yàn)用瓊脂培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中，于26C±lC培養(yǎng)2d?4d。哈夫尼亞菌則應(yīng)在22C?25C培養(yǎng)。加入6%o-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應(yīng)放在36C土lC培養(yǎng)4h再進(jìn)行觀察。A.9堿處理液A.9.10.5%氯化鈉溶液氯化鈉 0.5g蒸餾水 100mLA.9.20.5%氫氧化鉀溶液氫氧化鉀0.5g蒸餾水100mLA.9.3制法將