環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌落研究-生物工程畢業(yè)論文定稿

——學(xué)院2014屆本科畢業(yè)論文論文題目：環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌落研究學(xué)生姓名：——所在院（系）：生物工程系所學(xué)專業(yè)：生物工程專業(yè)導(dǎo)師姓名：——完成時間：2014年3月15日環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌落研究——（——學(xué)院生物工程系104班）摘要微生物發(fā)酵法合成環(huán)磷酸腺苷（cAMP）高產(chǎn)菌種是關(guān)鍵，本文采用高效液相色譜法測定不同菌落發(fā)酵液中環(huán)磷酸腺苷的含量篩選出cAMP高產(chǎn)菌落。通過活化不同節(jié)桿菌，挑選單菌落，分別編號1至6后移種進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中cAMP含量,結(jié)果6號菌落發(fā)酵液中cAMP含量最高為2.8957mg/ml，其次為4號菌落，環(huán)磷酸腺苷含量為2.5057mg/ml。本實驗初步篩選出環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌落為6號菌落；同時也發(fā)現(xiàn)在實驗中無菌操作是否規(guī)范、能否避免染菌是我們實驗成敗的關(guān)鍵。關(guān)鍵字：環(huán)磷酸腺苷，節(jié)桿菌，發(fā)酵，高效液相THEEFFECTOF：UsinghighperformanceliquidCyclicadenosinephosphatehigh-yieldstrainsscreened——(——School,DepartmentofBiologicalEngineering，Class104)ABSTRACTMicroorganismfermentationwassynthesizedadenosinemonophosphate(cAMP)highyieldstrainisthekey,thispaperadoptshighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodfordeterminingthecontentofcentraladenosinephosphateofdifferentcoloniesfermentedliquidscreenedcAMPhigh-yieldcolony.Throughactivationofdifferentsection,selectsinglecolony,number1to6backkindofferment,respectivelyafterfermentationcAMPcontentinthefermentedliquidbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC)method,theresults6coloniescAMPcontentinthefermentedliquidupto2.8957mg/ml,followedbycolony,4cyclicadenosinephosphatecontentis2.5057mg/ml.Thisexperimentpreliminaryscreeningcyclicadenosinephosphatehigh-yieldcolonyfor6colonies;Alsofoundintheexperimentofsterileoperationwhetherstandard,whethertoavoiddyebacteriumiskeyofsuccessorfailureinourexperiment.Keywords:Cyclicadenosinemonophosphate,Arthrobacterium,BiologicalFermentation，HPLC目錄1引言： 11.1環(huán)腺苷酸的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能 11.2環(huán)磷酸腺苷生產(chǎn)機(jī)制 22.材料與方法 32.1實驗材料 32.2實驗儀器 32.3實驗方法 32.3.1培養(yǎng)基 32.3.2移種與接種 32.4高效液相檢測環(huán)磷酸腺苷含量 42.4.1色譜測定條件 42.4.2樣品處理 42.4.3標(biāo)樣的配制 42.4.4標(biāo)樣的線性關(guān)系 52.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 53.實驗結(jié)果與分析 53.1實驗結(jié)果 53.1.1搖瓶發(fā)酵各參數(shù)測定 53.1.2高效液相測定發(fā)酵液中環(huán)磷酸腺苷的含量 63.2結(jié)果分析及討論 124結(jié)論 13參考文獻(xiàn) 14致謝: 15環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌落研究李成喜（新科學(xué)院生物工程系104班）1引言：環(huán)磷酸腺苷是核苷酸類藥物,在臨床上,主要用于治療心功能不全、心絞痛和心肌梗死,尤其適用于對洋地黃類強(qiáng)心藥中毒或不敏感的患者[1]。同時cAMP是機(jī)體代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其廣泛參與酶活性調(diào)節(jié)、基因表達(dá)以及細(xì)胞增殖與分化等，因而備受關(guān)注。上個世紀(jì)五、六十年代起,國外就陸續(xù)有文獻(xiàn)報道環(huán)磷酸腺苷的合成。但傳統(tǒng)的cAMP以化學(xué)合成為主，生產(chǎn)成本高，而且含有致癌致畸的化學(xué)殘留物，不適于臨床應(yīng)用[2]?，F(xiàn)在也有從大棗中提取，原料質(zhì)量要求高，處理過程繁雜且cAMP回收率較低。本研究利用節(jié)桿菌通過微生物發(fā)酵生成cAMP，具有很大發(fā)展前景[3]。環(huán)腺苷酸(CyclicAdenosineMonophosphate,cAMP)是由E.W.Sutherland于1957最早從哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的，并于1958年分離出環(huán)腺苷酸。Sutherland也因發(fā)現(xiàn)cAMP于1971年獲得生理和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎[4]。之后，人們相繼從植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)腺苷酸，并證明二者是生物界普遍存在的兩種生物活性物質(zhì)。世界各國的研究人員通過對cAMP大量的研究,結(jié)果表明cAMP在很多領(lǐng)域中起著重要的作用。所以cAMP的生產(chǎn)和檢測是十分重要而且必要的。高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）分析cAMP含量不僅簡便快速,而且選擇性好、準(zhǔn)確度高。1.1環(huán)腺苷酸的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能環(huán)磷腺苷，即：腺嘌呤核苷-3′，5′-環(huán)磷酸酯,簡稱cAMP，是由單核苷酸AMP分子中的磷酸與核糖形成3'，5'－環(huán)式結(jié)構(gòu)（見圖1）其分子式為:Cl0H12N5O6P，水合物為類白色或淡黃色結(jié)晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚熔點為219～220℃(分解)，比旋度為－51.3°(C=0.67)；它對酸、堿、熱都相當(dāng)穩(wěn)定，是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的熱點之一[3,4]。cAMP是人體中的一種重要生物活性物質(zhì)，它在細(xì)胞內(nèi)外快速雙向流動，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的cAMP可透過細(xì)胞膜進(jìn)入體液中，胞外的cAMP可被細(xì)胞攝取。同時環(huán)磷酸腺苷酸也是細(xì)胞內(nèi)傳遞激素和遞質(zhì)的中介因子，并作為第二信使參與多種生理生化過程的調(diào)節(jié)，在蛋白質(zhì)的合成過程中,基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯都受到cAMP的影響。環(huán)磷酸腺苷也可作為藥物中間體制備二丁酰環(huán)磷腺苷和環(huán)磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而發(fā)揮更有效的生理及藥理作用。環(huán)磷酸腺苷還可用于畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長激素的作用，促進(jìn)畜禽生長，增加優(yōu)質(zhì)禽產(chǎn)品產(chǎn)量。因此,研究工作和醫(yī)學(xué)臨床試驗均需大量的cAMP。圖1環(huán)腺苷酸結(jié)構(gòu)式1.2環(huán)磷酸腺苷生產(chǎn)機(jī)制環(huán)磷酸腺苷的合成主體上可分為兩大類，一是通過化學(xué)法合成；二是通過生物體合成。從上個世紀(jì)五、六十年代起，一系列的化學(xué)方法被用于合成環(huán)磷酸腺苷，如：堿性水解法、活性酯類法、DCC脫水法和三氯氧磷法[6]等。生物體合成是利用生物細(xì)胞的新陳代謝生成環(huán)磷酸腺苷。利用微生物合成cAMP，可分為發(fā)酵法，酶法。發(fā)酵法又分分段合成法和全合成法；酶法又分腺苷酸環(huán)化酶法和RNA分解法。本研究主要是利用微生物發(fā)酵法中的分段合成法，通過在含有碳源氮源的基本培養(yǎng)基上添加前體物質(zhì)，通過培養(yǎng)微生物細(xì)胞獲得大量的環(huán)磷酸腺苷。微生物cAMP的生物合成途徑[7]如圖2所示。圖2細(xì)菌圖2細(xì)菌的cAMP生物合成途徑與反饋調(diào)節(jié)（）（Acase為腺苷酸環(huán)化酶；PDase為磷酸二酯酶）cAMP的積累機(jī)制：(1)底物的攝?。?2)cAMP合成酶的開始；(3)生成的cAMP向細(xì)胞外分泌漏出。2.材料與方法2.1實驗材料實驗室存放活化后的節(jié)桿菌斜面。2.2實驗儀器超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、回轉(zhuǎn)式搖床、離心機(jī)、立式滅菌鍋、還原糖自動測定儀、高效液相色譜儀、平板式加熱器、雙筒顯微鏡、培養(yǎng)皿、pH試紙、試管、移液管、酒精燈、吸耳球、燒杯、量筒、玻璃棒2.3實驗方法2.3.1培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白陳1%，酵母膏5%，pH7.0[7,8]；種子培養(yǎng)基的配制：稱取4.0g葡萄糖，2.0g蛋白胨，10.0g酵母膏，溶于200ml蒸餾水中，調(diào)ph至7.0后分裝于6個250ml的三角瓶中，再用8層紗布和雙層報紙包扎瓶口滅菌備用。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，KH2PO41%，K2HPO41%，ZnSO4·7H2O

0.01%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，次黃嘌呤0.3%[7,8,9]；發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱取30g葡萄糖，6gKH2PO4，6gK2HPO4，0.06gZnSO4·7H2O，6g蛋白胨，3g酵母膏，1.8g次黃嘌呤，溶于600ml蒸餾水中，為了加快磷酸鹽的溶解可適當(dāng)加熱，完全溶解后調(diào)ph至7.5后分裝于18個250ml的三角瓶中，每瓶30ml，用8層紗布和雙層報紙包扎瓶口，并包6支5ml移液管與發(fā)酵培養(yǎng)基一起滅菌備用。2.3.2移種與接種將活化后的斜面種子移種至種子培養(yǎng)基8層紗布包扎三角瓶口28℃恒溫?fù)u瓶震蕩培養(yǎng)18小時以上，再接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%(V/V)[7]，8層紗布包扎三角瓶口30℃恒溫?fù)u瓶震蕩培養(yǎng)72以上小時。移種：超凈工作臺紫外照射30分鐘至1小時，關(guān)紫外燈開照明燈，開鼓風(fēng)機(jī)。挑選6個長勢較好的不同菌落分別進(jìn)行移種,每個菌落移種一個發(fā)酵瓶.具體操作如下:左手持活化試管，并將三角瓶封口解開，放置酒精燈火焰附近。右手取接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌、伸入斜面試管內(nèi)部冷卻。用接種環(huán)輕輕劃取斜面上的菌苔，再伸入三角瓶種子培養(yǎng)液輕輕攪動使菌體溶到培養(yǎng)液中；重復(fù)2到3次。移種完成后將三角瓶瓶口外層的2層報紙棄去，直接用8層紗布包扎，但不要污染瓶口處紗布。從超凈工作臺中取出種子培養(yǎng)瓶后28℃恒溫?fù)u瓶震蕩培養(yǎng)18小時以上，待生長到對數(shù)生長后期時移種至發(fā)酵培養(yǎng)液中。接種：超凈工作臺準(zhǔn)備如移種方法。在超凈工作臺中解開封口，每瓶種子液接種3瓶發(fā)酵樣瓶，分別編號11至13，21至23，31至33，41至43，51至53，61至63并用記號筆做好標(biāo)記。用移液管吸取3ml種子液分別接種到已編號的發(fā)酵樣瓶，同樣棄去封瓶口的上層的2層報紙，在不污染瓶口紗布的情況下包扎瓶口后30℃恒溫?fù)u瓶震蕩培養(yǎng)72小時以上。2.4高效液相檢測環(huán)磷酸腺苷含量2.4.1色譜測定條件柱溫為室溫；柱壓：19.11MPa；流速：1mL/min；波長：254nm；進(jìn)樣量：20μL；色譜柱：SinoChromODS-BP5μm；柱長：150×4.6mm。[4,5]流動相為V(甲醇):V(磷酸溶液)=25:75；磷酸溶液濃度為0.6%。流動相中只包含甲醇和磷酸溶液。將配置好的流動相加熱至70度左右，根據(jù)需要選擇0.45μm的濾膜，然后對流動相進(jìn)行抽濾。抽濾后對流動相進(jìn)行超聲脫氣10至20分鐘，備用[10,11]。2.4.2樣品處理發(fā)酵結(jié)束后得到的發(fā)酵液用5ml移液管移取3ml于3ml離心管中，每次移取發(fā)酵液時要用待移發(fā)酵液潤洗2至3次。離心管在5000轉(zhuǎn)每分鐘下離心15分鐘。離心結(jié)束后取上層清液，再經(jīng)0.45μm針式慮頭過濾后待測。2.4.3標(biāo)樣的配制精密稱取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品1000mg，用去離子水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到環(huán)腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為10mg/ml。精密稱量次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品54mg，用去離子水溶解定容與100ml容量瓶中，得到次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.54mg/ml。[3,11]2.4.4標(biāo)樣的線性關(guān)系精密吸取cAMP標(biāo)準(zhǔn)液1ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml分別定溶于50ml容量瓶中配制成0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg/ml六份標(biāo)準(zhǔn)液，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μl[4,5]，記錄色譜峰面積。環(huán)磷酸腺苷和次黃嘌呤的高效液相掃描圖譜如3.1.2中圖4，圖5所示。在0.2mg/ml至6.4mg/ml濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與樣品中環(huán)磷酸腺苷含量線性關(guān)系良好，線性關(guān)系圖如2.4.3中圖3所示。2.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制照2.3.1色譜條件，將處理好的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液放入自動進(jìn)樣器分別進(jìn)行掃描測定其峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度（mg/mL）縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，y=22948.598x-1475339.6，R2=0.9979。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，樣品掃描結(jié)果見3.1.2。圖圖3環(huán)腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線3.實驗結(jié)果與分析3.1實驗結(jié)果3.1.1搖瓶發(fā)酵各參數(shù)測定發(fā)酵結(jié)束后，按編號排好發(fā)酵瓶進(jìn)行參數(shù)測定。第一步：用50ml量筒量取各個發(fā)酵瓶中發(fā)酵液體積，做好記錄。第二步：用玻璃棒蘸去適量發(fā)酵液，滴在5.0至9.0量程的ph試紙上30秒內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對比測定ph，做好記錄。第三步：用5ml移液管移取3ml發(fā)酵液于3ml離心管中5000轉(zhuǎn)每分鐘，離心15分鐘。用移液管移取發(fā)酵液前，先用待移發(fā)酵液潤洗2到3次。第四步：取上層清液適量按上述色譜測定條件進(jìn)樣做高效液相測定。第五步：取上層清液適量于還原糖自動測定儀中測定發(fā)酵液中剩余還原糖的殘?zhí)橇?，做好記錄。結(jié)果如表1。表1搖瓶發(fā)酵體積、pH、殘?zhí)墙Y(jié)果編號發(fā)酵液體積（ml）Ph殘?zhí)橇?1276.72.67812265.50134521276.72.82822296.72.94723286.72.86331277.02.96832246.73.02833275.5041276.72.60044043286.72.64251296.72.70152296.72.72253276.72.71261296.71.57162286.72.24763256.72.2163.1.2高效液相測定發(fā)酵液中環(huán)磷酸腺苷的含量環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相圖如圖4，次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖如圖5圖4環(huán)腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖圖5次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖不同菌落發(fā)酵液樣品高效液相圖譜如圖6至圖23所示。圖6菌落11高效液相圖圖7菌落12高效液相圖圖8菌落13高效液相圖圖9菌落21高效液相圖圖10菌落22高效液相圖圖11菌落23高效液相圖圖12菌落31高效液相圖圖13菌落32高效液相圖圖14菌落33高效液相圖圖15菌落41高效液相圖圖16菌落42高效液相圖圖17菌落43高效液相圖圖18菌落51高效液相圖圖19菌落52高效液相圖圖20菌落53高效液相圖圖21菌落61高效液相圖圖22菌落62高效液相圖圖23菌落63高效液相圖由高效液相圖分析得到各編號發(fā)酵液中環(huán)腺苷酸的含量如表2表2發(fā)酵液中cAMP含量編號cAMP含量（mg/ml)112.249120.406132.344211.640221.338231.418310.591320.557330.547412.530422.583432.404511.995521.765531.980613.018622.729632.940菌落1至6發(fā)酵液環(huán)磷酸腺苷的平均含量如表3所示表3環(huán)磷酸腺苷平均含量菌落編號環(huán)磷酸腺苷平均含量(mg/ml)菌落12.2965菌落21.4653菌落30.574菌落42.5057菌落51.9133菌落62.89573.2結(jié)果分析及討論由3.1.2中不同菌落發(fā)酵液樣品高效液相圖6至圖23分別與圖4環(huán)磷酸腺苷、圖5次黃嘌呤的標(biāo)樣圖進(jìn)行對比可以看出,發(fā)酵液中產(chǎn)生的兩個吸收峰與標(biāo)樣圖的吸收峰幾乎在同一位置，說明發(fā)酵液中由微生物合成了一定量的環(huán)磷酸腺苷，同時也說明了發(fā)酵液中有一定量的次黃嘌呤殘余。在發(fā)酵培養(yǎng)基的配制中添加了0.3%的次黃嘌呤，由于微生物是將次黃嘌呤作為中間物進(jìn)行代謝利用，而不是作為碳源、氮源，所以需求量少。因此在發(fā)酵液中有一定量的次黃嘌呤殘余是正常情況。將各發(fā)酵液的高效液相圖中cAMP的波峰面積算出，再利用2.2.4中的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得發(fā)酵樣品中環(huán)磷酸腺苷的含量。最后得到的各發(fā)酵樣品中cAMP含量如3.2.1中表1所示。由表1測定結(jié)果可以看出編號12和編號33的發(fā)酵瓶有些異常，ph和還原糖的殘?zhí)橇慷籍愑谄渌幪?。這兩瓶發(fā)酵液中還原糖的殘余量為零，涂片后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有其他非棒狀桿菌和少量棒狀桿菌，由此斷定染菌，認(rèn)定這兩瓶發(fā)酵失敗。在計算菌落環(huán)磷酸腺苷的平均值時，編號12和編號23的cAMP含量值不計算在內(nèi)。其他各瓶發(fā)酵液ph基本一致，均含有少量還原糖，發(fā)酵狀況認(rèn)為正常。由表2所得各瓶發(fā)酵液中環(huán)腺苷酸的含量對比發(fā)現(xiàn)還原糖的殘?zhí)橇吭降?，則發(fā)酵液中環(huán)腺苷酸cAMP的含量越高。根據(jù)表3不同菌落發(fā)酵液中cAMP平均含量的計算結(jié)果，發(fā)現(xiàn)編號為6的菌落的發(fā)酵液中cAMP的平均含量最高為2.8957mg/ml，其次為菌落4環(huán)磷酸腺苷的平均含量為2.5057mg/ml，平均含量最低的是菌落3含量為0.574mg/ml。不同的菌落生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的能力差別較大，同一菌落的不同發(fā)酵樣瓶中環(huán)磷酸腺苷的含量也不盡相同。初步分析主要原因有兩個，一是用于實驗的菌落可能只達(dá)到菌落純，未達(dá)到菌株純；二是可能由于實驗過程中偶然的外界因素對單個發(fā)酵瓶產(chǎn)生了影響。若對菌落6進(jìn)一步進(jìn)行純種分離純化實驗，規(guī)范實驗操作定能篩選出環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌株。染菌分析：由于各發(fā)酵培養(yǎng)基是一起進(jìn)行高壓真氣滅菌，只有兩瓶發(fā)酵失敗，推斷培養(yǎng)基滅菌是徹底的，染菌可能是在進(jìn)行發(fā)酵接種時污染雜菌。在今后的無菌操作時，要特別加以小心注意。微生物發(fā)酵染菌是發(fā)酵過程中比較重要的問題，如何避免染菌是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵?？蓮囊韵聨追矫娼o于避免：一、確定種子不帶雜菌，從而可從源頭上避免雜菌污染；二、培養(yǎng)基滅菌要徹底，一般采用高壓蒸汽121℃，15分鐘到20分鐘；三、在種子液進(jìn)行移種和接種時的無菌操作要規(guī)范，通常在超凈工作臺中進(jìn)行，發(fā)酵瓶瓶口要靠近酒精燈火焰；四、接種過程瓶口不要對著風(fēng)屏，盡可能是與風(fēng)向平行，超凈工作臺中鼓風(fēng)機(jī)的采風(fēng)口要保持清潔衛(wèi)生，避免鼓入空氣帶菌。4結(jié)論國內(nèi)外目前生產(chǎn)cAMP多數(shù)是用腺苷和5′-腺苷酸作為起始原料合成環(huán)磷腺苷。以化學(xué)合成為主，操作復(fù)雜，溶劑損耗量大，收率低成本高，產(chǎn)量小，而且含有致癌致畸的化學(xué)殘留物，不適于臨床應(yīng)用。現(xiàn)也有人研究從大棗中提取環(huán)腺苷酸，但限于原料質(zhì)量要求高，處理過程繁雜且cAMP回收率較低不易推廣。通過本次試驗，初步說明環(huán)腺苷酸的生產(chǎn)除了通過化學(xué)合成和從生物細(xì)胞中提取外，還可以利用微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。通過初篩獲得高產(chǎn)菌落6和菌落4，若能進(jìn)一步對菌落進(jìn)行分離純化定能篩選出高產(chǎn)穩(wěn)定的純菌株。將環(huán)腺苷酸的生產(chǎn)與生物技術(shù)相結(jié)合，從而可以使環(huán)腺苷酸的生產(chǎn)周期短，分離提純?nèi)菀祝a(chǎn)品具有無化學(xué)殘留污染的優(yōu)點，具有廣闊的發(fā)展前景。參考文獻(xiàn)[1]王麗，蔣宗勇，林映才.環(huán)腺苷酸（cAMP）及其抗病生物學(xué)作用.飼料工業(yè)，2009[2]牟德華，朱艷麗.大棗環(huán)腺苷酸及其生物學(xué)功能.食品科技.2007,河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院[3]張明娟，李薇，龐曉明.棗果中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的提取工藝及含量測定.食品與發(fā)酵工業(yè).2012，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院[4]李學(xué)貴,蔣文強(qiáng),王傳芬.HPLC法測定大棗提取液中環(huán)腺苷酸含量的研究.山東化工.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院[5]崔志強(qiáng),孟憲軍,王傳杰.HPLC法測定冬棗環(huán)磷酸腺苷含量.食品研究與開發(fā).沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院[6]趙晉，田茂奎，唐巍.環(huán)磷腺苷合成工藝研究概述.理工科研，2008，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院[7]張克旭.環(huán)腺昔酸(cAMP)發(fā)酵的菌種選育與調(diào)節(jié)機(jī)制.發(fā)酵科技通訊，1980，天津輕工學(xué)院[8]應(yīng)漢杰.一種微生物生產(chǎn)環(huán)腺苷酸的方法.南京工業(yè)大學(xué).專利申請[9]CHEN,X.C.ETAL.:'Mediumoptimizationfortheproductionofcyclicadenosine3',5'-monophosphatebyMicrobacteriumsp.no.205usingresponsesurfaceMethodology'BIORESOURCETECHNOLOGYvol.100,no.2,2009,pages919-924[10]蒲云峰，萬英，侯旭杰.HPLC法測定不同品種紅棗中cAMP含量.食品研究與開發(fā).新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室[11]王荔，亓樹艷，莫曉燕.大棗環(huán)磷酸腺苷提取純化工藝的初步研究.食品科技.提取物與應(yīng)用.2012,西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院致謝:經(jīng)過近兩個月的實驗和整理論文，畢業(yè)設(shè)計即將結(jié)束，同時也標(biāo)志著我的大學(xué)生活即將接近尾聲。大學(xué)四年來在老師和同學(xué)們的幫助下，我努力學(xué)習(xí)掌握各種專業(yè)知識以及培養(yǎng)自己各方面的能力，盡自己的能力完成了我的學(xué)業(yè)。這次的畢業(yè)設(shè)計是一次交流和學(xué)習(xí)的機(jī)會，整個實驗和論文整理過程是一個不斷學(xué)習(xí)、不斷提高自己、積累自己經(jīng)驗的過程，我從中學(xué)到了很多新知識，更培養(yǎng)了自己的信心和毅力。在今后的工作和學(xué)習(xí)中，我會繼續(xù)發(fā)揚這段時間各項好的習(xí)慣和作風(fēng)，努力做好以后的每一項工作。本文是在——師的悉心指導(dǎo)下完成的，在跟隨常老師做實驗期間從她身上我學(xué)到的不僅僅是知識和實驗技能的操作,更多的是做人為事的道理。常老師治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn),要求嚴(yán)格，為人和藹,對我今后的學(xué)習(xí)工作都有很大幫助，同時在完成本實驗時也得到了康老師和實驗室其他老師在實驗試劑、實驗藥品、實驗儀器和實驗操作等方面提供的幫助和指導(dǎo)，及試驗組全體同學(xué)的協(xié)助，在此一并表示衷心的感謝！基于C8051F單片機(jī)直流電動機(jī)反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機(jī)的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機(jī)MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機(jī)溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機(jī)的通用控制模塊的研究基于單片機(jī)實現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機(jī)控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強(qiáng)型51系列單片機(jī)的TCP/IP協(xié)議棧的實現(xiàn)基于單片機(jī)的蓄電池自動監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機(jī)的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機(jī)的交流伺服電機(jī)運動控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機(jī)的泵管內(nèi)壁硬度測試儀的研制基于單片機(jī)的自動找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機(jī)的液壓動力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機(jī)實現(xiàn)一種基于單片機(jī)的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機(jī)的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機(jī)的噴油泵試驗臺控制器的研制基于單片機(jī)的軟起動器的研究和設(shè)計基于單片機(jī)控制的高速快走絲電火花線切割機(jī)床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機(jī)的機(jī)電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機(jī)的智能手機(jī)充電器基于單片機(jī)的實時內(nèi)核設(shè)計及其應(yīng)用研究基于單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機(jī)的煙氣二氧化硫濃度檢測儀的研制基于微型光譜儀的單片機(jī)系統(tǒng)單片機(jī)系統(tǒng)軟件構(gòu)件開發(fā)的技術(shù)研究基于單片機(jī)的液體點滴速度自動檢測儀的研制基于單片機(jī)系統(tǒng)的多功能溫度測量儀的研制基于PIC單片機(jī)的電能采集終端的設(shè)計和應(yīng)用基于單片機(jī)的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機(jī)單片機(jī)控制系統(tǒng)的研制基于單片機(jī)的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機(jī)的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機(jī)的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機(jī)控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機(jī)的多生理信號檢測儀基于單片機(jī)的電機(jī)運動控制系統(tǒng)設(shè)計Pico專用單片機(jī)核的可測性設(shè)計研究基于MCS-51單片機(jī)的熱量計基于雙單片機(jī)的智能遙測微型氣象站MCS-51單片機(jī)構(gòu)建機(jī)器人的實踐研究基于單片機(jī)的輪軌力檢測基于單片機(jī)的GPS定位儀的研究與實現(xiàn)基于單片機(jī)的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機(jī)系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機(jī)的時控和計數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機(jī)和CPLD的粗光柵位移測量系統(tǒng)研究單片機(jī)控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機(jī)應(yīng)用能力的探究基于單片機(jī)控制的自動低頻減載裝置研究基于單片機(jī)控制的水下焊接電源的研究基于單片機(jī)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機(jī)的氚表面污染測量儀的研制基于單片機(jī)的紅外測油儀的研究96系列單片機(jī)仿真器研究與設(shè)計基于單片機(jī)的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機(jī)的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)基于MSP430單片機(jī)的電梯門機(jī)控制器的研制基于單片機(jī)的氣體測漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機(jī)的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機(jī)和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測技術(shù)研究基于單片機(jī)的膛壁溫度報警系統(tǒng)設(shè)計基于AVR單片機(jī)的低壓無功補(bǔ)償控制器的設(shè)計基于單片機(jī)船舶電力推進(jìn)電機(jī)監(jiān)測系統(tǒng)基于單片機(jī)網(wǎng)絡(luò)的振動信號的采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的大容量數(shù)據(jù)存儲技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機(jī)的疊圖機(jī)研究與教學(xué)方法實踐基于單片機(jī)嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實現(xiàn)基于AT89S52單片機(jī)的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的多道脈沖幅度分析儀研究機(jī)器人旋轉(zhuǎn)電弧傳感角焊縫跟蹤單片機(jī)控制系統(tǒng)基于單片機(jī)的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學(xué)實驗中的應(yīng)用研究基于單片機(jī)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)通信研究與應(yīng)用基于PIC16F877單片機(jī)的莫爾斯碼自動譯碼系統(tǒng)設(shè)計與研究基于單片機(jī)的模糊控制器在工業(yè)電阻爐上的應(yīng)用研究基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究與開發(fā)基于Cygnal單片機(jī)的μC/OS-Ⅱ的研究基于單片機(jī)的一體化智能差示掃描量熱儀系統(tǒng)研究基于TCP/IP協(xié)議的單片機(jī)與Internet互聯(lián)的研究與實現(xiàn)變頻調(diào)速液壓電梯單片機(jī)控制器的研究基于單片機(jī)γ-免疫計數(shù)器自動換樣功能的研究與實現(xiàn)基于單片機(jī)的倒立擺控制系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)單片機(jī)嵌入式以太網(wǎng)防盜報警系統(tǒng)基于51單片機(jī)的嵌入式Internet系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)單片機(jī)監(jiān)測系統(tǒng)在擠壓機(jī)上的應(yīng)用MSP430單片機(jī)在智能水表系統(tǒng)上的研究與應(yīng)用HYPERLINK"/detail.htm?3