分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能優(yōu)秀課件

分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能第1頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

操作、設(shè)計(jì)與技能印跡技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)

李剛副教授第2頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月contentsNorthernBlot2SouthernBlot1WesternBlot3

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）4第3頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SouthernBlot原理與用途

原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。第4頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SouthernBlot操作步驟DNA瓊脂糖電泳

印跡轉(zhuǎn)移

預(yù)雜交

雜交（變性探針）

洗膜

放射自顯影或顯色。第5頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SouthernBlot操作步驟：第6頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)膜方法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（向上、向下）：DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于固相支持物表面。液體通過(guò)毛細(xì)管作用抽吸過(guò)凝膠,借助于一疊干燥的吸水紙巾產(chǎn)生并維持毛細(xì)管作用。轉(zhuǎn)移的速率取決于DNA片段的大小和凝膠中的瓊脂糖的濃度，小片段DNA（<1kb）在1h內(nèi)就能從0.7％的瓊脂糖上定量的轉(zhuǎn)移。大片段轉(zhuǎn)移慢且效率低。如15kbDNA的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至少要進(jìn)行18h,而且18h后轉(zhuǎn)移仍不完全。電轉(zhuǎn)移：需要使用帶電荷的尼龍膜來(lái)轉(zhuǎn)移，通常應(yīng)用于經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的小分子DNA片段。雙鏈DNA片段必須先經(jīng)過(guò)原位變性，隨后中和凝膠，并將其浸于電泳緩沖液中，最后將其夾放于大電泳槽內(nèi)平行電極之間的多孔板之間。完全轉(zhuǎn)移所需的時(shí)間取決于DNA片段的大小、凝膠的孔隙度以及外加電場(chǎng)的強(qiáng)度。通常在2－3小時(shí)內(nèi)可以轉(zhuǎn)移完畢。真空轉(zhuǎn)移：在真空條件下，DNA或RNA可以從凝膠上快速并定量地轉(zhuǎn)移。目前商品供應(yīng)的真空轉(zhuǎn)移裝置有數(shù)種。真空轉(zhuǎn)移較毛細(xì)管轉(zhuǎn)移更為有效，且更為快捷，一般30分鐘－60分鐘即可完成轉(zhuǎn)移。如果小心操作，經(jīng)真空轉(zhuǎn)移獲得的雜交信號(hào)比毛細(xì)管法增強(qiáng)2－3倍。第7頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southern印跡及雜交所使用膜的性質(zhì)

性質(zhì)硝酸纖維素膜中性尼龍膜帶電荷的尼龍膜結(jié)合容量（g核酸／CM2）80－120約100400－500實(shí)現(xiàn)最大結(jié)合能力所需的核酸大小>400bp>50bp>50bp固定真空條件下80C烘烤2h70C烘烤1h,無(wú)需真空條件；真空條件下80C烘烤2h70C烘烤1h,無(wú)需真空條件；或者溫和的堿性條件或者254nm紫外照射；潮濕的膜暴露于1.6kJ/m2;干燥的膜暴露于160kJ/m2商業(yè)產(chǎn)品Hybond－NGene－ScreenHybond-N+；Zeta-Probe；Nytran+；Gene-ScreenPlus第8頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

轉(zhuǎn)膜過(guò)程示意圖第9頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月探針標(biāo)記技術(shù)1標(biāo)記物：放射性和非放射性?xún)煞N放射性：32P，35S。非放射性：生物素、地高辛、熒光素。2、標(biāo)記方法（1）切口平移法：最經(jīng)典。（2）隨機(jī)引物法：最常用。（3）末端標(biāo)記法。（4）單鏈DNA探針標(biāo)記。（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法。第10頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

放射性探針的標(biāo)記方法1、切口平移法：目前已經(jīng)很少使用。2、隨機(jī)引物法：DNA聚合酶可沿單鏈模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列是隨機(jī)的，它們就可在模板的多位點(diǎn)上與模板雜交。因此模板上每一核苷酸的互補(bǔ)物將以同樣的頻率摻入產(chǎn)物。用一種［－32P］標(biāo)記的dNTP及其他三種非標(biāo)記dNTP作為前體合成標(biāo)記DNA,可產(chǎn)生比活為5108-5109dpm/g的探針。第11頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

SouthernBlot操作要點(diǎn)一般Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30μg的DNA。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg/μl為好，加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過(guò)1/10，DNA樣品一定要消化完全。如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化；如果反應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化，然后補(bǔ)加鹽類(lèi)等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，再加第二種酶進(jìn)行消化。標(biāo)記后的探針可以直接使用或過(guò)柱純化后使用。由于-32P的半衰期只有14天，所以標(biāo)記好的探針應(yīng)盡快使用。探針的比活性最好大于109計(jì)數(shù)/分/μl。鮭魚(yú)精DNA的作用是封閉NC膜上沒(méi)有DNA轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，降低雜交背景、提高雜交特異性。

第12頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SouthernBlot操作要點(diǎn)在洗膜的過(guò)程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過(guò)程無(wú)論在哪一步達(dá)到終點(diǎn)，都必須停止洗膜。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天時(shí)間。洗片時(shí)，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時(shí)間，再洗第二張片子。

影響Southern雜交實(shí)驗(yàn)的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點(diǎn)等。第13頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

SouthernBlot注意事項(xiàng)1.要取得好的轉(zhuǎn)移和雜交效果，應(yīng)根據(jù)DNA分子的大小，適當(dāng)調(diào)整變性時(shí)間。對(duì)于分子量較大的DNA片段（大于15kb），可在變性前用0.2MHCl預(yù)處理10min使其脫嘌呤。2.轉(zhuǎn)移用的膜要預(yù)先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果；不可用手觸摸膜，否則影響DNA的轉(zhuǎn)移及與膜的結(jié)合。3.轉(zhuǎn)移時(shí)，注意膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果。4.注意同位素的安全使用。5.進(jìn)行Southern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。放射性標(biāo)記靈敏度高，效果好；地高辛標(biāo)記沒(méi)有半衰期，安全性好。第14頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SouthernBlot常見(jiàn)問(wèn)題分析1、DNA太少，雜交的敏感度不夠高；2、DNA太多，酶切不完全，雜交條帶不完全；3、使用太高電壓電泳：膠熔化或電泳條帶沒(méi)有完全分開(kāi)；4、預(yù)雜交時(shí)封閉不完全：背景高，出現(xiàn)無(wú)法解釋的結(jié)果；5、洗膜不充分：背景高，出現(xiàn)無(wú)法解釋的結(jié)果；6、過(guò)度洗膜：特異性結(jié)合的核酸條帶被洗掉；第15頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一張同位素放射自顯影的Southernblot照片第16頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一張地高辛顯色的Southernblot照片第17頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southernblot操作視頻第18頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月NorthernBlot原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。第19頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月NorthernBlot操作過(guò)程

RNA提取

甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光第20頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Northernblot操作注意事項(xiàng)1.基本注意事項(xiàng)和Southernblot相似;2.獲得高質(zhì)量的RNA是做好Northernblot的關(guān)鍵;3.操作過(guò)程要小心、仔細(xì)，防止RNA樣品的降

解。第21頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Northernblot操作視頻第22頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot原理：將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀(guān)察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過(guò)條帶的密度大小來(lái)進(jìn)行特異性蛋白的半定量。第23頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Westernblot操作過(guò)程SDS電泳

轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影。第24頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

SDS－PAGE電泳示意圖第25頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電泳后轉(zhuǎn)膜，然后用特定的抗體來(lái)檢測(cè)靶蛋白第26頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第27頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrolHours04816第28頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題（1）蛋白質(zhì)電泳：常用SDS：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套！第29頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題（2）轉(zhuǎn)膜：戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致！以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極。排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。膜用麗春紅染色觀(guān)察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。第30頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題（3）封閉：用5％脫脂奶粉或3％BSA。（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）時(shí)間：室溫2h或4oC過(guò)夜第31頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題（4）顯色或顯影：顯色：辣根過(guò)氧化物酶：底物為DAB。堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT?；瘜W(xué)發(fā)光顯影：最常用。辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次，

曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定。第32頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題（5）膜的再利用：化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用StrippingBuffer洗滌后（洗滌Buffer:62.5mmpH6.7的Tris-HCI含2％SDS和100mm的－2ME），用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交。第33頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Westernblot操作視頻第34頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。第35頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA常用的酶和底物

辣根過(guò)氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm；底物為T(mén)MB，藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm。

堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）,黃色，檢測(cè)波長(zhǎng)405nm。

ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間：

包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml。

封閉：37oC2h

或4oC過(guò)夜（3％BSA）。

樣本反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h。

酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間：37oC45min-1h。顯色時(shí)間：15min(避光）。

實(shí)驗(yàn)要設(shè)對(duì)照。

可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?。?6頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA的類(lèi)型1.間接法測(cè)抗體：間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。方法：抗原包被封閉待檢抗體洗滌酶標(biāo)二抗洗滌顯色反應(yīng)終止反應(yīng)ELISAReader檢測(cè)OD值。第37頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA的類(lèi)型2.雙抗體夾心法測(cè)抗原：是檢測(cè)抗原最常用的方法。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體

單克隆抗體＋單克隆抗體

后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用

于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。第38頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA的類(lèi)型3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原：(1)抗體固相測(cè)抗原：小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。方法：抗體包被封閉同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原洗滌酶底物顯色ELISAreader檢測(cè)。第39頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA的類(lèi)型3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原：（2）抗原固相測(cè)抗原：其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的標(biāo)記過(guò)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法:a:抗原包被96孔板；b:封閉;c:待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間；d:加入96孔板；

e:洗滌；f：加入酶標(biāo)二抗；

g：洗滌；h：顯色和檢測(cè)。如臨床血清樣本的檢測(cè)以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測(cè)。第40頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第41頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ELISA的類(lèi)型4.IgM抗體的檢測(cè):(1)間接法：

間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。步驟：

a:抗原包被96孔酶標(biāo)板；b: