基因組的提取及電泳鑒定

基因組的提取及電泳鑒定第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)課考試1.最后2學(xué)時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)課考試

2.開卷,內(nèi)容為實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)內(nèi)容。

第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、加樣器的使用及注意事項(xiàng)1、用途2、如何使用？2.1根據(jù)取樣量，選擇合適的加樣器。5ul、50ul、500ul，應(yīng)選擇哪個加樣器?頂部標(biāo)有加樣器的最大量程，分別為：20ul:

0.5~20l100/200ul:20~100/200l1000ul:200ul~1000l實(shí)驗(yàn)儀器的使用及注意事項(xiàng)第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)：加樣器讀數(shù)為100，實(shí)際體積各為多少?2.2如何調(diào)節(jié)？(1)首先觀察目前讀數(shù),假設(shè)為050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l

(2)順時針調(diào)節(jié)---讀數(shù)變小逆時針調(diào)節(jié)---讀數(shù)變大(3)注意：調(diào)節(jié)前加樣器讀數(shù)正處于最大量程或最小量程時，如果向錯誤方向調(diào)節(jié)，馬上會超出量程，將會損害加樣器的精度。第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.3加樣器使用步驟(示教及學(xué)生練習(xí))：1）選擇加樣器,觀察讀數(shù),調(diào)節(jié)讀數(shù)，吸頭的安裝要緊密。

不要用手直接拿吸頭，安上吸頭后一定要再固定一下。2）吸取液體前，先打到第一擋。3）將吸頭插入液面下適當(dāng)深度，過深可能會腐蝕加樣器,過淺可能會吸入空氣。4）緩慢松開拇指,吸取液體。松開過快，液體上沖會腐蝕加樣器;完全放開拇指后，停留約半秒鐘,急于離開液面，容易吸入空氣。5）抬起加樣器,估計體積是否正確,將外壁液體用容器口引流回去6）(吸頭內(nèi)有液體時，不能將加樣器倒置或平放，以防液體倒流損壞加樣器！),貼容器內(nèi)壁，將液體勻速打出，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出并立即棄于廢物盒內(nèi).第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、打開電源2、離心管中的液體為2/3,蓋緊蓋子,防止離心機(jī)被腐蝕。二、離心機(jī)的使用注意事項(xiàng)1代表轉(zhuǎn)速盤上方的數(shù)據(jù)，2代表下方的數(shù)據(jù)。3、樣品配平,對稱放入離心機(jī)(管的連接處朝外).4、設(shè)定離心時間(如設(shè)定2分鐘，可定時多點(diǎn)時間，再用手表記時)。5、統(tǒng)一離心，逐漸升到要求轉(zhuǎn)速。第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)一、

真核細(xì)胞基因組DNA的

提取、酶切及電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握人外周血基因組DNA的提取技術(shù)。

2.學(xué)習(xí)酶切技術(shù)3.學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和技術(shù)。第一部分：裂解血細(xì)胞、蛋白酶k消化第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀第三部分：酶切、DNA電泳實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（到8：30~8:40）第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）取0.3ml抗凝血置于1.5mlEppendorf管中.2）加入1mlSTMT溶液，充分混勻，靜置5min，使其溶血。3）9,000rpm,離心3分鐘(統(tǒng)一離心)。4）棄上清。彈管底重懸沉淀。注意:離心時離心機(jī)內(nèi)樣品要平衡

實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)第一部分：裂解紅細(xì)胞、蛋白酶K消化8：40~9：15

STMT溶液：S:Sugar8%T:TritonX-1001%

M:MgCl20.5mMT:Tris-HCl10mM(PH:8.0)

作用：用Triton細(xì)胞膜上打孔，裂解細(xì)胞。第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月4）加0.4ml生理鹽水，懸浮細(xì)胞。5）9000rpm,離心3分鐘(統(tǒng)一離心)，棄上清，彈勻。6）加460lNE溶液，混勻。7）加30l10%SDS,迅速混勻。8）加50l蛋白酶K(20mg/ml),混勻，

置50°C水浴1小時。操作注意事項(xiàng)：1、混勻時確認(rèn)沉淀已被懸起。2、注意30ul、50ul加樣體積準(zhǔn)確。第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：a.陰離子型去污劑，溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分

b.使蛋白質(zhì)變性

c.將細(xì)胞膜、核膜破壞；對核酸酶有抑制作用N:NaCl50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金屬離子螯合劑，抑制DNase的活性(螯合DNase發(fā)揮活性所需的2價陽離子)。各種試劑的作用1、NE溶液：2、SDS：十二烷基硫酸鈉終濃度0.5%3、蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)是廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質(zhì)，將DNA游離。第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月一、核酸提取的主要步驟課間介紹真核細(xì)胞基因組在提取過程中一般有以下幾步:1)破碎細(xì)胞；2)去除蛋白質(zhì)，糖類等等生物大分子；由于真核細(xì)胞基因組較大，在純化出的ＤＮＡ的操作中應(yīng)注意動作輕柔，且在低溫下進(jìn)行，以最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對ＤＮＡ的剪切，從而獲得相對完整的ＤＮＡ3)沉淀核酸第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化瓊脂糖電泳PCRDNA提取步驟圖解酚氯仿抽提第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月重蒸酚:

酚的作用是變性蛋白質(zhì)，而對DNA結(jié)構(gòu)沒有影響。無色酚的氧化產(chǎn)物(如醌等,粉紅色)破壞磷酸二脂鍵。重蒸酚是將酚中的酚的氧化產(chǎn)物去除。TE溶液:

Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)

作用：提供略堿的pH值，保證DNA溶于水相。在酸性條件下，DNA分配于有機(jī)相。8-羥基喹啉：

0.1%黃色酚相指示劑抗氧化劑作用：去除蛋白等雜質(zhì)。酚對蛋白有強(qiáng)烈的變性作用，用酚和氯仿抽提樣品，可以使樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，可通過離心去除。為防止其對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，一般再用氯仿抽提去除殘留的酚。1、TE飽和重蒸苯酚：第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月氯仿作用：

a.氯仿的變性作用不如酚好，

但與酚共同/交替使用可增強(qiáng)去蛋白效果；b.氯仿有加速有機(jī)相和水相的分離、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；2、酚/氯仿3、氯仿/異戊醇(24:1)氯仿的作用：去除DNA水溶液中殘留的微量酚。異戊醇的作用：減少操作過程中氣泡的產(chǎn)生。第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月在單價陽離子存在的情況下，乙醇可以使DNA發(fā)生沉淀。可離心收集

.核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，能與很多陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會被變性。最常用沉淀劑為1價鈉、鉀、胺和鋰等離子的鹽類，如醋酸鈉、NaCl、氯化鋰、氯化鉀等常用有機(jī)沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇、精胺等。5、無水乙醇：作用：提供單價陽離子。4、醋酸鈉：3MNaAcpH:5.2第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月課間休息同學(xué)自己練習(xí)：加樣器使用提示：

（1）吸頭的安裝要緊密。（2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當(dāng)深度（3）緩慢松開拇指，吸取液體。拇指完全放開后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（4）將外壁液體用容器口引流回容器。吸頭內(nèi)的體積應(yīng)大致正確。（5）貼目的容器內(nèi)壁，將液體勻速打到目的容器內(nèi)，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出。十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。蛋白酶K,再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得總DNA溶液。10:00上課第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1、加入550ul(等體積)TE飽和酚,混勻1min.10,000rpm,2min。

(注意抽取下層酚相;酚可腐蝕加樣器等,加樣器頭用過即棄掉)

(輕柔混勻，避免DNA鏈斷裂;但是太輕又起不到變性蛋白的作用)

2、將上層水相移至一新管中

(要盡量抽盡，又不可吸起酚相)。加入500ul(等體積)酚/氯仿(已經(jīng)配好，體積比1:1),

同上條件混勻、離心。3、將上層水相移至一新管中。加入500ul(等體積)氯仿-異戊醇，同上條件離心、取上清。4、加入1/10體積（約30ul）醋酸鈉于上清中充分混勻。加入2-2.5倍體積無水乙醇（約1ml）

（通常加滿小離心管），

混勻后交給老師，（統(tǒng)一置）-20℃1h(或-70℃

10min)。實(shí)驗(yàn)第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月乙醇沉淀后午休。注意事項(xiàng)：1）本實(shí)驗(yàn)將用到的TE飽和重蒸苯酚、氯仿/異戊醇是有機(jī)試劑，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我們總是取上清。2）在抽取完苯酚、氯仿等有機(jī)試劑，不能將加樣器平放或倒置，以防液體導(dǎo)流損壞加樣器，加完樣后立即棄掉加樣器頭。3）

基因組DNA由于太大，非常容易受機(jī)械剪切而斷裂，因此，為了得到完整的基因組DNA，盡量不要多次進(jìn)行物理性操作。第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月7、加入13l

雙蒸水,溶解沉淀，-20℃保存。

6、10,000r/min離心5min，棄上清。8l：酶切、電泳余5l：PCR模板（下次課進(jìn)行）。藍(lán)頭黃頭濾紙條(吸干內(nèi)壁液體)觀察DNA沉淀的顏色。一定要充分溶解沉淀第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月8、基因組DNA的酶切：基因組DNA8ul

10xBufferH1ul

EcoRI(最后加入)0.6ul

置37℃保溫45min。實(shí)驗(yàn)第三部分：基因組DNA的酶切1:00~2:20第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月課間介紹（2）：1.酶切相關(guān)知識1、酶活性單位Unit（U）：

1U:是指在1小時內(nèi)，適當(dāng)溫度下(37°C)，在50ul

反應(yīng)體系中，將1ugoflambdaDNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。2、酶切體系：

10×反應(yīng)緩沖液：提供內(nèi)切酶反應(yīng)最適pH值及所需離子。

雙蒸水：無細(xì)菌和其他酶類污染。

BSA：100-200ug/ml，保護(hù)酶蛋白不失活。內(nèi)切酶：含50%甘油，-20℃保存。反應(yīng)體積：一般根據(jù)底物DNA的量來計算。反應(yīng)體系中甘油濃度應(yīng)<5%。

第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1.Southernblot

DNA水平基因結(jié)構(gòu)分析的重要策略之一.

基因組DNA酶切電泳后可以直接用于Southernblot轉(zhuǎn)膜。2.構(gòu)建基因組文庫3.PCR的模板

克隆表達(dá)基因

分析基因一級結(jié)構(gòu)的變化基因組PCR產(chǎn)物的酶切電泳可以分析基因多態(tài)性；利用內(nèi)參法可以相對定量分析特定基因在基因組上的拷貝數(shù)。課間介紹

提取模板DNA的常見目的：基因組DNA的鏈很長，常用的蛋白酶K酚抽提法由于機(jī)械剪切力的作用，很難獲得完整的DNA分子,可獲得100kb-150kb大小的DNA片斷，可滿足下述實(shí)驗(yàn)用途。第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA瓊脂糖凝膠電泳1.內(nèi)切酶消化后的DNA片段瓊脂糖凝膠取下硝酸纖維素膜標(biāo)記探針雜交袋4.將硝酸纖維素膜放入雜交袋中,預(yù)雜交;雜交:與標(biāo)記的核酸探針;洗膜放射自顯影后的X光底片將硝酸纖維素膜與X-光片曝光2.變性中和3.轉(zhuǎn)膜5.放射自顯影或顯色Southern

Blot基本過程第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)第四部分、DNA質(zhì)量檢測－－－瓊脂糖電泳一、原理

DNA分子在pH8.0的電泳環(huán)境中，帶負(fù)電荷，在一定強(qiáng)度電場力的作用下，從負(fù)極向正極遷移。電泳樣品載體瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，煮沸冷卻后形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)，電泳中起分子篩作用。通常情況下，分子量大的DNA電泳過程中由于受到的阻力較大，泳動速率較慢，反之，分子量較小的DNA片段跑在前面。第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月二、常用試劑上樣液成份：

1．0.25%溴酚藍(lán)或/和0.25%二甲苯青（樣品指示劑）2．40%蔗糖或30%甘油（增加樣品比重），利于加樣。電泳緩沖液：

TAE為例

T:Tris堿A:冰醋酸E:EDTA

提供有一定緩沖能力的pH值(8.0),EDTA可抑制DNase的作用。溴化乙錠（EB）：染色劑一種熒光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA的堿基之間。在紫外光激發(fā)下能發(fā)出紅色的熒光。致癌劑第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1%瓊脂糖凝膠電泳。在樣品中加2～3ul6×上樣液，混勻，加入上樣孔內(nèi)．電泳條件：100