第八章微生物遺傳與育種

第八章微生物遺傳與育種什么是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)？一、三大經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1.經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1928

F.Griffith

以Streptococcus

pneumoniae（肺炎鏈球菌）為研究對(duì)象。它使人患肺炎，鼠患敗血癥。S.pneumoniae有兩種菌株：S型：有莢膜，菌落表面光滑（Smooth）,有致病性R型：無(wú)莢膜，菌落表面粗糙（Rough）,無(wú)致病性第一節(jié) 微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)1）動(dòng)物試驗(yàn)2）細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)說(shuō)明在死的S型細(xì)菌體內(nèi)可能存在某種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，可以進(jìn)入R型菌細(xì)胞，使R性菌株獲得表達(dá)S型莢膜性狀的遺傳物質(zhì)。3）S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)活R菌+S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液培養(yǎng)皿培養(yǎng)大量R菌和少量S菌1944年，O.T.Avery等從熱死S型菌株提純了幾種可能的轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化。第一證據(jù)確定DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)2.

噬菌體感染實(shí)驗(yàn)1952年，A.D.Hershey&M.

Chase

利用噬菌體感染實(shí)驗(yàn)證明DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。3.

植物病毒重建實(shí)驗(yàn)1956年，H.Fraenkel-Conrat

用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）與霍氏車(chē)前花葉病毒(HMV)進(jìn)行著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)，證明RNA是病毒的遺傳物質(zhì)。三大經(jīng)典實(shí)驗(yàn)證明核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)TMVHRVHRVTMV原始株

拆開(kāi)重建感染分離純化植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能1953年Watson

和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。DNA由四種核苷酸組成，每種核苷酸由磷酸、脫氧核糖和堿基組成，DNA分子中有A、T、C、G四種堿基。DNA兩條核苷酸鏈以堿基互補(bǔ)配對(duì)形成氫鍵并盤(pán)旋形成雙螺旋。直徑20nm。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型直徑三、微生物中遺傳物質(zhì)的存在部位和方式細(xì)胞水平原核生物大部分的DNA存在于核區(qū)（核質(zhì)體），真核生物的存在細(xì)胞核內(nèi)。不同種微生物的細(xì)胞核或核區(qū)的數(shù)目有所不同。如：Aspergillus

niger(黑曲霉）A.oryzae

(米曲霉）單核 桿菌細(xì)胞 兩核區(qū)雙核 球菌細(xì)胞 一個(gè)核區(qū)3)

同種微生物不同細(xì)胞中細(xì)胞核或核區(qū)的數(shù)目也有所不同。如：藻狀菌類(lèi)（真菌）和放線(xiàn)菌的菌絲細(xì)胞為多核，孢

子為單核.2.

細(xì)胞核水平除核基因組外，還有核外染色體真核細(xì)胞核外染色體有：細(xì)胞質(zhì)基因：線(xiàn)粒體、葉綠體共生生物：草履蟲(chóng)的卡巴顆粒，屬于Caedibacter屬的共生細(xì)菌2um質(zhì)粒：存在Saccharomycecerevisiae(釀酒酵母)細(xì)胞核，不與核基因組整合。原核細(xì)胞核外染色體統(tǒng)稱(chēng)質(zhì)粒。如：F因子（F質(zhì)粒）

R因子（R質(zhì)粒）Ti質(zhì)粒等3.

染色體水平染色體數(shù)目：不同微生物染色體數(shù)目差別比較大，真核微生物有較多染色體，原核生物每個(gè)核區(qū)僅一個(gè)染色體。染色體倍數(shù)：?jiǎn)伪扼w：細(xì)胞中只有一套染色體。雙倍體：細(xì)胞中含有兩套功能相同的染色體。自然界的微生物多數(shù)是單倍體，少數(shù)微生物如S.cerevisiae(釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，兩個(gè)單倍體性細(xì)胞接合成的合子為雙倍體。4.

核酸水平核酸種類(lèi)：大部分微生物的遺傳物質(zhì)是DNA，部分病毒少數(shù)噬菌體的遺傳物質(zhì)是RNA核酸結(jié)構(gòu)：大部分微生物的DNA是雙鏈，雙鏈DNA有環(huán)狀（原核生物和部分病毒）、線(xiàn)狀（部分病毒）、超螺旋狀（質(zhì)粒DNA）；少數(shù)病毒如E.coli

的ΦX174和fd噬菌體等的DNA為單鏈。DNA長(zhǎng)度：即基因組的大小，用bp(堿基對(duì))、kb、Mb為單位，不同微生物基因組的大小差別很大，表現(xiàn)出多樣性。已經(jīng)了解30多種微生物基因數(shù)據(jù)。5.

基因水平基因是生物體內(nèi)一切具有自主復(fù)制能力的最小遺傳單位。眾多基因構(gòu)成染色體。從基因的功能來(lái)看，原核生物的基因是通過(guò)調(diào)控系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮功能。啟動(dòng)基因（啟動(dòng)子）基因調(diào)控系統(tǒng)操縱子

操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因：真核微生物的基因與原核微生物的最明顯差異：無(wú)操縱子，有大量不編碼序列和重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯被分隔，基因被內(nèi)含子阻隔。四、原核生物的質(zhì)粒1、定義與構(gòu)型質(zhì)粒：是DNA分子，游離原核生物核基因組或染色體以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型的遺傳因子。有三種構(gòu)型：CCC型：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋dsDNA。OC型：開(kāi)放環(huán)型L型：線(xiàn)型2.

質(zhì)粒的類(lèi)型1）F質(zhì)粒：F

因子、致育因子、性因子與育性有關(guān)的質(zhì)粒是E.coli等細(xì)菌決定性別、具有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。大小100kb，CCC型質(zhì)粒。F+菌株：攜帶F質(zhì)粒的菌株稱(chēng)F+菌株（雄性）。F-菌株：不攜帶F質(zhì)粒的菌株稱(chēng)F-菌株（雌性）。組成：轉(zhuǎn)移起點(diǎn)

可轉(zhuǎn)移因子轉(zhuǎn)移區(qū)（tra區(qū)）2）

R質(zhì)粒：抗性因子、R因子與抗性有關(guān)的質(zhì)粒由兩部分組成：抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）：主要含調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因、轉(zhuǎn)移基因，具有轉(zhuǎn)移功能?？剐詻Q定因子：r-決定因子，主要含各種抗性基因如Tetr、Ampr

等基因，有些R質(zhì)粒使宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗金屬離子抗性?？剐詻Q定因子抗性轉(zhuǎn)移因子R質(zhì)粒由兩部分組成：抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）抗性決定因子由兩部分組成：抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）抗性決定因子3）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素質(zhì)粒與細(xì)菌素的產(chǎn)生有關(guān)的質(zhì)粒大腸桿菌素由E.coli某些菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素，具有通過(guò)抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等方式專(zhuān)一殺死或抑制近緣細(xì)菌或同種不同菌株的能力，是由

Col質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)。Col質(zhì)粒有兩類(lèi)：分子量?。?kb，5×106），無(wú)接合作用，松弛型控制，多拷貝。如ColE1。分子量大（94kb，8×107），具通過(guò)接合而轉(zhuǎn)移的功能，嚴(yán)緊型控制，1-2拷貝。如ColIb。The

ColE1

plasmid

carries

the

following

genes:cea

：the

colicin

toxinimm

：immunity

proteinkil

：lysis

proteininc：

RNA

I

-

incompatibility

determinantRNA

II：

primer

for

replicationrop：

protein

that

regulates

priming

and

copy

numbermob：

proteins

for

mobilization

during

conjugationcer：

maintains

plasmid

as

monomersexc：

exclusion

protein細(xì)胞毒素區(qū)轉(zhuǎn)移區(qū)受體結(jié)合區(qū)胞壁質(zhì)4)

Ti

質(zhì)粒：誘癌質(zhì)粒、冠癭質(zhì)粒與致病性有關(guān)的質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）侵染雙子葉植物的根細(xì)胞，釋放出Ti質(zhì)粒，通過(guò)Ti質(zhì)粒的T-DNA與植物核基因組整合，合成正常植物沒(méi)有的冠癭堿類(lèi)，在植物上形成癌細(xì)胞。Ti

質(zhì)粒，環(huán)狀，200kb，主要分四部分：毒性區(qū)（Vir）接合轉(zhuǎn)移區(qū)（con）復(fù)制啟始區(qū)T-DNA區(qū)毒性區(qū)（Vir）接合轉(zhuǎn)移區(qū)（con）復(fù)制啟始區(qū)T-DNA區(qū)5)

Ri質(zhì)粒與再生根形成有關(guān)的質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒相似，有Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的根部不形成根瘤，僅生出可再生新植株的毛狀根。在基因工程中，Ri

質(zhì)粒作為外源基因的載體。6）mega質(zhì)粒：巨大質(zhì)粒存在根瘤菌屬（Rhizobium）中,質(zhì)粒上有一系列于與共生固氮有關(guān)的基因，分子量大（2.0×108

）。7）降解性質(zhì)粒：代謝性質(zhì)粒主要存在假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌內(nèi)。質(zhì)粒DNA上含有能降解某些復(fù)雜有機(jī)物的酶的編碼基因，細(xì)菌攜帶該類(lèi)質(zhì)粒可將復(fù)雜化合物降解簡(jiǎn)單形式或能源。8）隱秘質(zhì)粒（Cryptic

plasmid）隱秘質(zhì)粒：不賦予寄主任何表型效應(yīng)的質(zhì)粒。只有通過(guò)物理檢測(cè)才能發(fā)現(xiàn)。3.

質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒的不親和性：又稱(chēng)不相容性，是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親和性現(xiàn)象主要和復(fù)制與分配有關(guān)。在同一個(gè)細(xì)胞中含有兩種不相容的質(zhì)粒；隨著細(xì)胞的分裂，質(zhì)粒分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去；在下一次細(xì)胞分裂之前，質(zhì)粒拷貝數(shù)加倍；兩種不相容質(zhì)粒的拷貝數(shù)比例發(fā)生變化，只含有一種類(lèi)型質(zhì)粒的子細(xì)胞五、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子的同義詞：轉(zhuǎn)座子(元)（Transposon）轉(zhuǎn)位子(Trans-position)插入序列（Insertional

sequence）轉(zhuǎn)座元件(因子)(Transposible

element)可移動(dòng)因子(Mobile

element)控制因子(Controllingelement)跳動(dòng)基因(Jumping

gene)介紹40年代初，BarbaraMcClintock(1902-1992)發(fā)現(xiàn)玉米基因組中存在可在不同區(qū)域轉(zhuǎn)移的控制元件，命名為控制因子（Controllingelement）或轉(zhuǎn)座子（Transposable

element）。隨后在果蠅中發(fā)現(xiàn)，但未引起注意。60年代末，分子水平上證實(shí)E.coli（大腸桿菌）存在轉(zhuǎn)座子，引起了科學(xué)家的注意。目前認(rèn)為，在原核、真核生物的基因組中均存在轉(zhuǎn)座子，包括人類(lèi)。Barbara

McClintock

(1902-1992)Cold

Spring

Harbor

Laboratory,

NY20世紀(jì)40年代，她在玉米(zea

mays,akacorn)上發(fā)現(xiàn)第一個(gè)轉(zhuǎn)座子，并注意到轉(zhuǎn)座子會(huì)引起基因的insertions,deletions

and

translocations。發(fā)表發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的文章：McClintock

B，1951.Chromosomeorganization

and

genic

expression

.

ColdSpring

Harbor

Symp.Quant.

Biol,.16:13-57.1983年，獲得Nobel

PrizeinPhysiology

and

Medicine

“for

herdiscovery

of

mobil

geneticelements”諾貝爾獎(jiǎng)?wù)罗D(zhuǎn)座子種類(lèi)(一)、插入序列（

Insertion

sequence,IS）最早被鑒定的轉(zhuǎn)座子是細(xì)菌操縱子中的自主插入序列，它的插入阻止插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子稱(chēng)為插入序列。IS元件是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分，是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，每個(gè)元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)。IS元件結(jié)構(gòu)反向末端重復(fù)（IR）+轉(zhuǎn)座酶基因。一般結(jié)構(gòu)IS1結(jié)構(gòu)IS元件結(jié)構(gòu)特性IS元件兩末端為短的反向末端重復(fù)（Inverted Terminal

Repeats,IR）。IS元件的中間（兩IR之間）為編碼轉(zhuǎn)座所需的酶的DNA序列。末端的IR總是和很短的正向重復(fù)序列連接。正向重復(fù)序列通常為受體DNA的靶位點(diǎn)。對(duì)一特定的IS元件，靶位點(diǎn)長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)是恒定的。(二)、復(fù)合轉(zhuǎn)座子復(fù)合轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)左臂（L）+中心序列+右臂(R)。中心序列帶抗藥性標(biāo)記或其他結(jié)構(gòu)基因。左臂和右臂由IS元件組成。兩IS元件的排列可以是正向的或相反方向。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)一般結(jié)構(gòu)（三）、轉(zhuǎn)座子的遺傳特性1、轉(zhuǎn)座子插入某個(gè)基因之中或附近，會(huì)降低或抑制基因的表達(dá)。（三）、轉(zhuǎn)座子的遺傳特性2、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座后，在轉(zhuǎn)座子兩端產(chǎn)生短的正向重復(fù)序列。（三）、轉(zhuǎn)座子的遺傳特性3、轉(zhuǎn)座子的一部分序列可以轉(zhuǎn)錄mRNA，其編碼產(chǎn)物有些（轉(zhuǎn)座酶）與轉(zhuǎn)座有關(guān)。（三）、轉(zhuǎn)座子的遺傳特性4、大多數(shù)轉(zhuǎn)座子右端有AATAAA結(jié)構(gòu)，它與mRNA的poly(A)化有關(guān)。5、同一種生物基因組中可能存在多種轉(zhuǎn)座子。如標(biāo)準(zhǔn)E.coli菌株中有8個(gè)IS1、5個(gè)IS2和5個(gè)IS3。6、有些轉(zhuǎn)座子為一種復(fù)合結(jié)構(gòu)，由2個(gè)或2個(gè)以上的不同轉(zhuǎn)座子組成。第二節(jié)微生物的基因突變基因突變簡(jiǎn)稱(chēng)突變廣義突變：細(xì)胞內(nèi)或病毒顆粒內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生可遺傳的變化。包括基因突變和染色體畸變。狹義突變：基因突變（點(diǎn)突變）一、幾個(gè)概念遺傳型（genotype）：基因型，指生物個(gè)體所包含的全部遺傳因子，即基因組所攜帶的遺傳信息。表型（phenotype）：表現(xiàn)型，指某一生物所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在適合環(huán)境條件下通過(guò)代謝和發(fā)育得到的具體體現(xiàn)。遺傳型 環(huán)境條件（可能性）表型（現(xiàn)實(shí)性）代謝、發(fā)育變異：指生物體在某種外因或（和）內(nèi)因作用下，所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。特點(diǎn)：幾率低（10-5~10-10），性狀變化大，新性狀穩(wěn)定、可遺傳。飾變（modification）：指外表的修飾性改變，是一種不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而僅發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點(diǎn)：群體幾乎所有個(gè)體發(fā)生同樣變化，性狀變化幅度小，且不穩(wěn)定、不可遺傳。野生型(wildtype)：從自然界中分離到的微生物菌株，稱(chēng)野生型菌株，簡(jiǎn)稱(chēng)野生型。突變型：野生型菌株經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱(chēng)突變株，或突變體、突變型。選擇性突變株與非選擇性突變株：凡是能用選擇性培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)條件快速選擇出來(lái)的突變株稱(chēng)選擇性突變株，反之稱(chēng)為非選擇性突變株突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀的突變幾率，稱(chēng)突變率。突變率也表示每單位群體在在繁殖一代時(shí)產(chǎn)生突變株的數(shù)目。如：突變率為10-8表示細(xì)胞在108次分裂中會(huì)發(fā)生一次突變，或表示108個(gè)細(xì)胞的群體分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)可產(chǎn)生一個(gè)突變株。二、突變的類(lèi)型(一)、微生物發(fā)生選擇性突變的類(lèi)型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）如亮氨酸缺陷型菌株表示為L(zhǎng)eu-，對(duì)應(yīng)的野生型表示為L(zhǎng)eu+抗性突變型（resistant

mutant）如抗鏈霉素菌株表示為Strr，對(duì)應(yīng)的敏感型菌株表示為Strs。2)

條件致死突變型(conditional

lethal

mutant)(二)、微生物發(fā)生非選擇性突變的類(lèi)型：形態(tài)突變型（morphological

mutant）抗原突變型（antigenic

mutant）由于基因突變引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生突變的變異類(lèi)型，如細(xì)胞壁缺陷、莢膜或鞭毛變異。

產(chǎn)量突變型（metabolitequantitativemutant）通過(guò)基因突變獲得在有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高于原始菌株的突變株的變異類(lèi)型。產(chǎn)量提高一般逐步積累。三、微生物基因突變的特點(diǎn)自發(fā)性：沒(méi)有人為誘變因素可自發(fā)產(chǎn)生稀有性：突變率比較低，范圍10-6~10-9獨(dú)立性：某基因突變率不受別的基因影響。多基因同時(shí)突變幾率極低。可誘變性：誘變劑可提高突變率穩(wěn)定性：突變后新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。規(guī)律性：特定性狀具有較穩(wěn)定的突變率的規(guī)律。7)

可逆性：野生型突變型正向突變回復(fù)突變8)

不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與引起突變的原因（環(huán)境）之間無(wú)直接的關(guān)系。兩種觀點(diǎn)：抗生素、紫外線(xiàn)或高溫誘變產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的突變性狀（非自發(fā)性）。認(rèn)為突變是通過(guò)生物對(duì)某特定環(huán)境

(例如化學(xué)藥物、抗生素和高溫等)的適應(yīng)而產(chǎn)生的，這種環(huán)境正是突變的誘因，所產(chǎn)生的抗性性狀是與該環(huán)境因素相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是環(huán)境因素對(duì)生物體的“馴化”、“馴養(yǎng)”、“蒙導(dǎo)”或“定向變異”。抗生素、紫外線(xiàn)或高溫淘汰原有非突變個(gè)體（自發(fā)

性）?？剐酝蛔兪强梢宰园l(fā)產(chǎn)生的，即使誘發(fā)產(chǎn)生，其產(chǎn)生的性狀與誘變因素間也是不對(duì)應(yīng)的，即最終

適應(yīng)了的化學(xué)藥物等不良因素并非誘變因素，而僅

僅是一種用于篩選的環(huán)境而已。有三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)證明自發(fā)突變產(chǎn)生突變株。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明取敏感于噬菌體的E.coli指數(shù)期的肉湯培養(yǎng)物，用新鮮培養(yǎng)稀釋成濃度為103/mL的細(xì)菌懸液，然后在甲、乙兩試管各裝10mL。接著把甲管中的菌液先分裝在50支小試管中(每管0.2

mL)，保溫24-36h。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明把各小管的菌液分別倒在50個(gè)預(yù)先涂滿(mǎn)噬菌體T1的平板上，經(jīng)培養(yǎng)后分別計(jì)算各皿上所產(chǎn)生的抗噬菌體的菌落數(shù)。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明乙管中的

10mL菌不經(jīng)分裝先整管保溫24—36

h，然后分成50份分別倒在同樣涂滿(mǎn)T1的平

板上，經(jīng)同樣培養(yǎng)后，也分別計(jì)算各皿上所產(chǎn)生的抗噬菌體菌落數(shù)。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明結(jié)果：在來(lái)自甲管的50皿中，各皿出現(xiàn)的抗

性菌落數(shù)相差

極大，而來(lái)自

乙管的則各皿

上抗性菌落數(shù)

基本相同。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明結(jié)論：

E．coli抗噬菌體性狀的產(chǎn)生，并非由所抗的環(huán)境因素

(即噬菌體T1)誘導(dǎo)出來(lái)的，而是在它接觸

T1前，在某次細(xì)胞分裂過(guò)程中自發(fā)產(chǎn)生的。微生物突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性證明四、基因突變的分子基礎(chǔ)1.誘發(fā)突變（induced

mutation）通過(guò)人為的方法利用物理、化學(xué)、生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。誘變劑：凡具有誘變效應(yīng)的任何因素。1)

堿基的置換僅涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，屬點(diǎn)突變轉(zhuǎn)換(transition)：嘌呤之間置換或嘧啶之間的置換。置換顛換(transversion)：嘌呤和嘧啶之間的置換。誘發(fā)突變包括：引起置換的誘變劑：直接：直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)誘變。如亞硝酸、羥胺、環(huán)氧乙酸等間接：通過(guò)活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子引起突變。如堿基類(lèi)似物8-氮鳥(niǎo)嘌呤、5-氨基尿嘧啶等2)

移碼突變誘變劑使DNA序列中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使后面的全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的突變。正常：GCG

ATC

CGT

AAC

CTG

ATG

GTT

AAC插入：GCT

CGA

TCC

GTA

ACC

TGA

TGG

TTA

AC缺失：GCA

TCC

GTA

ACC

TGA

TGG

TTA

AC引起移碼突變的誘變劑： 啶類(lèi)染料如 啶橙等3)

染色體畸變（chromosomal

aberration）誘變劑引起DNA分子的大損傷，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復(fù)、插入、易位和倒位等變化和染色體數(shù)目的改變。誘變劑：理化因子：X-ray、烷化基、亞硝酸、秋水仙素。生物因子如轉(zhuǎn)座子2.

自發(fā)突變指生物體在無(wú)人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變自發(fā)突變的原因：由背景輻射和環(huán)境因素引起，如天然的宇宙射線(xiàn)等。由微生物自身有害代謝產(chǎn)物引起，例如過(guò)氧化氫等。由DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起。堿基錯(cuò)配頻率為10-7~10-10。五、DNA損傷的修復(fù)紫外線(xiàn)對(duì)DNA的損傷主要引起相鄰嘧啶發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)形成嘧啶二聚體（TT、TC、CC）和水合物，造成局部DNA分子無(wú)法配對(duì)，從

而引起微生物的死亡或突變。DNA損傷類(lèi)型很多，微生物對(duì)其修復(fù)的方法也各不相同。1.

光復(fù)活作用（photoreactivation）最早是A．Kelner(1949年)在Streptomyces

griseus

(灰色鏈霉菌)中發(fā)現(xiàn)。光復(fù)活作用：把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見(jiàn)光下時(shí)，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。修復(fù)機(jī)理在黑暗下，嘧啶二聚體和光解酶(光裂合酶)結(jié)合，形成DNA—酶復(fù)合物，在300—500nm可見(jiàn)光下，酶獲得光能激活，使二聚體重新分解成單體，同時(shí)，光解酶與復(fù)合物分解，重新執(zhí)行功能。光解酶(photolyase):(隨菌種不同而略相對(duì)分子質(zhì)量為5.5×104-6.5×104有差異)。含兩個(gè)輔助因子FADH，8-羥基脫氮核黃素或次甲基四氫葉酸2.切除修復(fù)(excision

repair)又稱(chēng)暗修復(fù)（dark

repair）不依賴(lài)可見(jiàn)光，通過(guò)酶切作用去除嘧啶二聚體，重新合成一段正常DNA鏈的修復(fù)方式。暗修復(fù)的機(jī)理①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’-側(cè)切開(kāi)一個(gè)3’-OH和5‘-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條鏈為模板，從原有鏈上的

3’-OH端起逐個(gè)延長(zhǎng)，重新合成一條缺失的DNA鏈；④通過(guò)連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3'-OH末端與原鏈的5'-P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。第三節(jié) 微生物的誘變一、化學(xué)誘變(Chemical

mutagens)<一>、化學(xué)誘變劑引起遺傳變化的方式直接方式將堿基類(lèi)似物錯(cuò)誤整合到DNA中。改變DNA上的已有堿基，誘發(fā)堿基錯(cuò)配。間接方式:通過(guò)誘發(fā)易錯(cuò)修復(fù)機(jī)制，間接引起堿基錯(cuò)配。<二>、化學(xué)誘變劑1.

堿基類(lèi)似物(Base

analogs)嘧啶類(lèi)似物：如5-溴尿嘧啶(5-BU)嘌呤類(lèi)似物：如8-氮鳥(niǎo)嘌呤（8-NG）以間接方式誘變，引起堿基發(fā)生置換。堿基類(lèi)似物作用機(jī)理：堿基類(lèi)似物參與堿基堆積作

用，使其鄰近的堿基殘基發(fā)生部分旋轉(zhuǎn)，引起堿基對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)換。如：5-BU引發(fā)A=T

G≡C5-溴尿嘧啶引發(fā)A=T

G

≡

C2.

烷化劑類(lèi)(Alkylatingagents)最常用試劑是單功能烷化劑,即僅一個(gè)烷化基團(tuán)起作用,引起鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，引起G≡CA=T轉(zhuǎn)換。烷基磺酸烷脂：甲基磺酸乙酯(EMS)甲基磺酸甲酯(MMS)亞硝基化合物：N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NG)氮芥（

Nitrogen

mustards

）3.

移框誘變劑移框突變劑主要是雜環(huán)化合物吖啶的衍生物原黃素5-氨基吖啶3，6-氨基吖啶插入到DNA雙鏈堆積堿基間。引起堿基缺失4.

其他誘變劑1)

亞硝酸（nitrous

acid）使鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶發(fā)生氧化脫氨基作用將氨基轉(zhuǎn)換為酮類(lèi)。腺嘌吟次黃嘌呤，與胞嘧啶配對(duì)。胞嘧啶尿嘧啶，與腺嘌呤配對(duì)。鳥(niǎo)嘌呤黃嘌呤，不能與嘧啶配對(duì)，是致死突變。引起兩種轉(zhuǎn)換A=TG≡C和G≡CA=T腺嘌吟次黃嘌呤，與胞嘧啶配對(duì)Nitrous

acid

removes

NH2

,replaced

with

keto（酮類(lèi)）2)

羥胺（hydroxylamine）一種位點(diǎn)專(zhuān)一性誘變劑，專(zhuān)門(mén)攻擊胞嘧啶，在細(xì)菌中，反應(yīng)產(chǎn)物是5,6-二氫-6-羥氨-胞嘧啶，其亞胺形式與A配對(duì)，引起C

≡GT=A的轉(zhuǎn)換。3)

金屬化合物重金屬對(duì)微生物的毒害。4)

抗生素二、物理誘變熱能高壓輻射紫外線(xiàn)離子射線(xiàn)（

Ionizing

radiation

）

X-ray,α-ray,γ-ray。輻射誘變?cè)颍?/p>

DNA和RNA中的嘌呤和嘧啶有很強(qiáng)的紫外光吸收能力最大吸收峰在260nm。紫外輻射能殺死細(xì)胞，是因?yàn)樗茏饔肈NA，使DNA分子形成嘧啶二聚體，即兩個(gè)相鄰的嘧啶共價(jià)連接。

DNA復(fù)制到這一位置時(shí)，

聚合酶放上不正確核苷酸的機(jī)率會(huì)大增。紫外線(xiàn)輻射源就是殺菌的紫外燈，它能發(fā)射大量的260nm波長(zhǎng)的輻射，常用劑量為能殺死群體中大約90％～95％細(xì)胞的劑量三、生物誘變噬菌體細(xì)菌或放線(xiàn)菌等微生物，多數(shù)有感染噬菌體的現(xiàn)象。在篩選抗噬菌體的突變株中，常出現(xiàn)抗生素產(chǎn)量伴隨著有明顯提高的抗性菌株。噬菌體，特別是溶原性噬菌體，是一種遺傳信息的傳遞者，因而把噬菌體看作一種誘變劑。第四節(jié)

微生物基因轉(zhuǎn)移與重組Cell

WallCell

MembraneCytoplasm細(xì)菌染色體遺傳Bacteria

Have

Circular

ChromosomesTermination

ofReplicationOrigin

ofReplicationChromosomeReplicationEnd

of

replicationTwo

chromosomesReplication

goesin

both

directionsOriginalChromosomeStart

of

replicationTheta

(q)

structureMid

replicationBinary

Fission一、原核生物的基因轉(zhuǎn)移與重組原核生物的基因重組的特點(diǎn)為：片段性，僅一小段DNA序列參與重組；單向性，即從供體菌向受體菌(或從供體基因組向受體基因組)作單方向轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。<一>、轉(zhuǎn)化(transformation)1.定義轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。轉(zhuǎn)化子：通過(guò)轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱(chēng)轉(zhuǎn)化子。2．轉(zhuǎn)化微生物的種類(lèi)原核微生物肺炎鏈球菌Streptococcus

pneumoniae嗜血桿菌屬Haemophilus芽孢桿菌屬Bacillus根瘤菌屬Rhizobium假單胞菌屬Pseudomonas黃單胞菌屬Xanthomonas真核微生物釀酒酵母Saccharomyces

cerevisiae()、粗糙脈孢菌Neurosporacrassa黑曲霉Aspergillus

niger3.感受態(tài)(competence)感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。兩個(gè)菌種或菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，依賴(lài)于親緣關(guān)系,但是凡能發(fā)生轉(zhuǎn)化，受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)。不同微生物感受態(tài)細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)期不同：如S．Pneumoniae在指數(shù)期后期，Bacillus

sp.在穩(wěn)定期不同微生物感受態(tài)細(xì)胞在群體中占的比例不同如枯草芽孢桿菌：20％左右 流感嗜血桿菌：100％不同微生物感受態(tài)細(xì)胞維持感受態(tài)的時(shí)間不同如枯草芽孢桿菌感受態(tài)維持幾小時(shí)流感嗜血桿菌僅維持?jǐn)?shù)分鐘。4.

感受態(tài)因子細(xì)菌生長(zhǎng)到一定時(shí)期，分泌出特異性蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞處于感受態(tài)的蛋白稱(chēng)感受態(tài)因子。主要成分：膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白：細(xì)胞壁自溶素核酸酶5.

轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。轉(zhuǎn)化因子的類(lèi)型dsDNAssDNA質(zhì)粒DNA在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同：Gˉ細(xì)菌(Haemophilus)：dsDNAG＋細(xì)菌(Streptococcus)：ssDNA5.轉(zhuǎn)化過(guò)程①供體菌strRdsDNA與感受態(tài)受體菌strS細(xì)胞表面的膜連DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，其中一條進(jìn)入細(xì)胞；②供體菌的ssDNA片段被細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白R(shí)ecA結(jié)合后，與受體菌核染色體雜合DNA區(qū)段；③雜合DNA區(qū)隨受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制；④細(xì)胞分裂后，形成一個(gè)轉(zhuǎn)化子(strR)和一個(gè)具原來(lái)基因型(strS)的子代。Bacterium

undergoingtransformation影響轉(zhuǎn)化率的因素：受體細(xì)胞的感受態(tài)：決定轉(zhuǎn)化因子是否可進(jìn)入受體細(xì)胞受體細(xì)胞的限制性?xún)?nèi)切酶系統(tǒng)和核酸酶：決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解受體和供體染色體的同源性：決定轉(zhuǎn)化因子是否整合。Agrobacterium

to

plant

transfer

mechanismSheng

andCitovsky,1996,

ThePlant

Cell,8:1699細(xì)菌轉(zhuǎn)化的人工方法：A:

CaCl2法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的細(xì)菌離心后，懸浮在預(yù)冷的低滲CaC12溶液中。將DNA加入后形成的鈣-DNA復(fù)合物便會(huì)吸附在細(xì)菌細(xì)胞的表面。繼而將細(xì)菌短暫加熱(熱激)，DNA便會(huì)被轉(zhuǎn)送到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。。機(jī)制：CaCl2可增加細(xì)胞的通透性。B:電轉(zhuǎn)化法將細(xì)胞置于電場(chǎng)之中時(shí)，細(xì)胞膜被極性化，會(huì)產(chǎn)生跨膜電位差。若電位差超過(guò)閾值，在細(xì)胞膜上會(huì)暫時(shí)形成小孔。外源DNA大分子通過(guò)小孔進(jìn)入細(xì)胞。CellsgohereElectroporationcuvetteHigh

voltageshock〈二〉、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)1.

定義轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)子：通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式而形成的雜種后代，稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。The

mechanism

ofgeneralized

transduction.

Inreality,

only

a

very

smallminority

of

phage

progeny(1

in

10,000)

carries

donorgenes2.轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類(lèi)（1）普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱(chēng)為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。又可以分為：完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體病毒外殼把完全不含自身DNA的供體DNA“

誤包”成完全缺陷型噬菌體。當(dāng)其感染寄主后，寄主細(xì)胞不能被溶源化，不顯示其對(duì)噬菌體的免疫性，以及發(fā)生溶菌裂解和產(chǎn)生正常的噬菌體后代。完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱(chēng)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive

transduction)、經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源

DNA在其內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制、也不迅速消失，而表現(xiàn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這一現(xiàn)象就稱(chēng)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)(restricted

transduction)通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。又可分為：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：形成少數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，10-4～10-6高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：50%的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。Bio：合成生物素的基因Gal：發(fā)酵半乳糖的基因局限轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)：只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因，一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因；特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；缺陷噬菌體的形成是由于它在脫離宿主核染色體過(guò)程中，發(fā)生低頻率的誤切而形成；局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過(guò)UV等因素對(duì)溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。溶源轉(zhuǎn)變當(dāng)正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體基因整合到宿：主的核基因組上，而使宿主獲得了除免疫性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)溶源轉(zhuǎn)變。溶源性細(xì)菌溶源轉(zhuǎn)變與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)，但本質(zhì)上不同：①溶源轉(zhuǎn)變不攜帶任何外源基因的正常噬菌體；②賦予宿主新性狀是噬菌體的基因，不是供體菌的基因；③新性狀是宿主細(xì)胞溶源化時(shí)的表型，溶源化后形成溶源性細(xì)菌，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子；④溶源轉(zhuǎn)變獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時(shí)消失?！慈?、接合(conjugation)1.

定義與證據(jù)1)

定義接合：通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過(guò)程。接合：供體菌(“雄性”)通過(guò)性菌毛與受體菌(“雌性”)直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為接合。接合子：通過(guò)接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱(chēng)為接合子能進(jìn)行接合的微生物主要是細(xì)菌和放線(xiàn)菌，以G-細(xì)菌最為普遍。2)

證據(jù)G-菌和G+菌的質(zhì)粒均可發(fā)生自我轉(zhuǎn)移，但是G+菌的轉(zhuǎn)移區(qū)比G-菌小，接合時(shí)不需要傘毛，但需要外激素2、接合型菌株的類(lèi)型根據(jù)F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在方式，可把E．coli分成4種不同接合型菌株。F＋菌株：即“雄性”菌株細(xì)胞內(nèi)存在一至幾個(gè)F質(zhì)粒，細(xì)胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。F-菌株：即“雌性”菌株細(xì)胞中無(wú)F質(zhì)粒、細(xì)胞表面也無(wú)性菌毛的菌株。Hfr菌株(高頻重組菌株，high

frequency

recombination

strain

)細(xì)胞中F質(zhì)粒從游離態(tài)轉(zhuǎn)變成核染色體組特定位點(diǎn)上的整合態(tài)，菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率非常高，所以稱(chēng)為Hfr菌株。F’菌株：當(dāng)Hfr菌株細(xì)胞內(nèi)的F質(zhì)粒因不正常切離而脫離核染色體組時(shí)，可重新形成游離的、但攜帶整合位點(diǎn)鄰近一小段核染色體基因的特殊F質(zhì)粒，稱(chēng)F’質(zhì)?；騀’因子。凡攜帶F’質(zhì)粒的菌株，稱(chēng)為F’菌株。3、雜交1) F+

×

F-

F+當(dāng)F＋菌株與F—菌株接觸時(shí)，通過(guò)F＋菌株性菌毛的溝通和收縮，F(xiàn)質(zhì)粒由F＋菌株轉(zhuǎn)移至F-菌株中，同時(shí)F＋菌株中的F質(zhì)粒也獲得復(fù)制，兩者都為F＋菌株。F質(zhì)粒DNA接合轉(zhuǎn)移具體過(guò)程：A.在F＋菌株F質(zhì)粒DNA的一條單鏈特定位點(diǎn)（又稱(chēng)轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)，ori

T

）上產(chǎn)生裂口。F＋菌株F質(zhì)粒DNAB.

兩條DNA鏈分開(kāi)，斷裂的單鏈(B)逐步解開(kāi)，留存的環(huán)狀單鏈(A)以“滾環(huán)式”復(fù)制互補(bǔ)單鏈(A’)。C.

含裂口的單鏈(B)以5’端為先導(dǎo)，以線(xiàn)形方式經(jīng)過(guò)性菌毛而轉(zhuǎn)移到F-菌株。d)

在F-中，線(xiàn)形外源

DNA單鏈(B)合成互補(bǔ)雙鏈(B-B’)，經(jīng)環(huán)化后，形成新的F質(zhì)粒，完成F-至F+的轉(zhuǎn)變。2、

Hfr

×

F-

→

FHfr菌株的染色體向F-菌株的轉(zhuǎn)移過(guò)程與F質(zhì)粒自F＋轉(zhuǎn)移至F-基本相同。Hfr與F-接合過(guò)程：①Hfr與F-細(xì)胞配對(duì)。②兩細(xì)胞通過(guò)性菌毛直接接觸，形成接合管；③發(fā)生接合中斷后，F(xiàn)-成為部分雙倍體，在其體內(nèi)，供體細(xì)胞(Hfr)的單鏈DNA復(fù)制互補(bǔ)鏈。④外源雙鏈DNA與受體菌(F-)的染色體DNA進(jìn)行雙交換，形成穩(wěn)定的接合子。3、

F’

×

F-

F’脫落并環(huán)化轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合的總結(jié)〈四〉、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合（protoplast

fusion）：通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程，稱(chēng)為原生質(zhì)體融合。由原生質(zhì)體融合獲得的重組子，稱(chēng)為融合子(fusant)。原生質(zhì)體融合的一般步驟制備原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體再生篩選融合子二、真核微生物的基因轉(zhuǎn)移與重組基因重組方式：有性生殖準(zhǔn)性生殖原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化1、有性生殖有性生殖，指性細(xì)胞間發(fā)生接合和進(jìn)行染色體重組產(chǎn)生后代的生殖方式。能產(chǎn)生有性孢子的微生物均能進(jìn)行有性生殖。真菌有性生殖與其他生物相同，分三個(gè)主要階段：①質(zhì)配(plasmogamy)，兩個(gè)單倍體細(xì)胞結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的融合使兩個(gè)細(xì)胞核處于同一個(gè)細(xì)胞中；由質(zhì)配而組合到一個(gè)細(xì)胞中的兩個(gè)核分別來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的親本，這種雙核細(xì)胞稱(chēng)為雙核體(dikaryon)。有些子囊菌和擔(dān)子菌，隨著菌絲生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的繼續(xù)，雙核細(xì)胞中的兩個(gè)核可同時(shí)分裂，兩對(duì)子核分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞中，這一過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行而使雙核狀態(tài)得以延續(xù)，并產(chǎn)生雙核菌絲。②核配(karyogamy)，兩個(gè)細(xì)胞核融合在一起形成一個(gè)雙倍體核；有些微生物類(lèi)群質(zhì)配后緊接著進(jìn)行核配，但有些類(lèi)群質(zhì)配與核配的發(fā)生在時(shí)間和空間上均可相隔甚遠(yuǎn)③減數(shù)分裂(meiosis)，產(chǎn)生遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)重組的單倍體細(xì)胞核。絕大多數(shù)真菌由或早或晚發(fā)生的核配而產(chǎn)生的雙倍體核，經(jīng)減數(shù)分裂后均產(chǎn)生單倍體的有性孢子。不同真菌類(lèi)群的有性孢子的名稱(chēng)不同：卵孢子(oospores)接合孢子(zygospores)子囊孢子(ascospores)擔(dān)孢子(basidiospores)：有的真菌是雌雄同體的(hermaphroditic)，即在同一菌體上產(chǎn)生不同的雄性和雌性器官。雌雄同體菌若是自體親和的，單個(gè)菌株就可完成有性生殖。少數(shù)真菌是雌雄異體的(dioecious)，在同一個(gè)種內(nèi)，有雌雄兩類(lèi)菌體，分別只產(chǎn)生雌性和雄，性生殖器官，有性生殖的進(jìn)行，需要雌雄菌體的共同參與。真菌的有性生殖器官稱(chēng)為配子囊

(gametangia)，配子囊產(chǎn)生稱(chēng)為配子

(gametes)的性細(xì)咆，或包含具有配子功能的細(xì)胞核。同形配子囊(isogametangia)：雌雄配子囊和雌雄配子形態(tài)相似無(wú)區(qū)別。異形配子囊(heterogametangia)：雌雄配子囊和雌雄配子形態(tài)不同。雄性配子囊叫做雄器(antheridia)雌性配子囊根據(jù)類(lèi)群的不同，叫做產(chǎn)囊體(ascogonia)或藏卵器(oogonia)。大部分真菌沒(méi)有性的分化，在形態(tài)上沒(méi)有雌雄菌株的區(qū)分。根據(jù)有性生殖時(shí)的性親和性，可將真菌分為三種類(lèi)型：①同宗配合(homothallic)真菌：每個(gè)菌體均是自體可育的(self-fertile)，不需要其他菌體的參與就可

進(jìn)行并完成有性生殖，這類(lèi)真菌沒(méi)有交配型之分，也不可能進(jìn)行異型雜交(outcrossing)；②異宗配合(heterothallic)真菌：菌體自體不育

(self-sterile)，有兩個(gè)具親和性和不同交配型的菌體進(jìn)行結(jié)合才能進(jìn)行有性生殖，為專(zhuān)性異型雜交類(lèi)真菌；③次級(jí)同宗配合(secondaryhomothallic)真菌：一些異宗配合真菌在產(chǎn)生孢子時(shí)，將具有相對(duì)交配型的兩個(gè)細(xì)胞核并入一個(gè)孢子，這種孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌體是自體可育的，因此表現(xiàn)為同宗配合，這種情況稱(chēng)為擬同宗異宗配合(pseudohomothallism)。2、異核現(xiàn)象真菌是真核生物中惟一一類(lèi)主要以單倍體狀態(tài)在在的生物。單倍體生物的全部基因暴露于選擇壓力之下?；虻耐蛔儗?dǎo)致：引起適應(yīng)力的喪失或降低，突變很快被消除；

引起適應(yīng)力的增強(qiáng)，突變將被保留并快速擴(kuò)增。結(jié)果：真菌快速適應(yīng)環(huán)境的短期變化，但是不能儲(chǔ)存變異。雙倍體生物的突變基因相對(duì)于野生型來(lái)說(shuō)是隱性的，不會(huì)立即表達(dá)，易被積累，在有性生殖時(shí)產(chǎn)生不同的組合，形成具有突變基因的大量后代，可獲得具有優(yōu)勢(shì)的突變基因組合。真核世界中的生物大多數(shù)為雙倍體，說(shuō)明雙倍體具有進(jìn)化上的優(yōu)勢(shì)。絲狀真菌在一個(gè)共同的或(通過(guò)隔膜孔)連續(xù)的細(xì)胞質(zhì)中含有多個(gè)細(xì)胞核，個(gè)別細(xì)胞核中發(fā)生的基因突變可以被其他核中的野生型基因所掩蓋，從而使突變成為隱性的。當(dāng)絲狀真菌產(chǎn)生單核孢子或產(chǎn)生源于單

個(gè)細(xì)胞核的菌絲分枝時(shí)，突變基因則被

周期性或間歇性地暴露于選擇壓力之下。絲狀真菌在具有單倍體生物所擁有的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，也獲得了雙倍體生物的部分優(yōu)勢(shì)。這可能就是真菌在雙倍體生物占優(yōu)勢(shì)的真核世界中，一直保持單倍體的原因。在真菌中，含有不同基因型的細(xì)胞核可

以在同一菌絲體和同一菌絲細(xì)胞中并存。同一個(gè)體含有不同類(lèi)型細(xì)胞核的現(xiàn)象叫做異核現(xiàn)象(heterokaryosis)，表現(xiàn)異核現(xiàn)象的個(gè)體叫做異核體(heterokaryon)。含有同一基因型細(xì)胞核的個(gè)體叫做同核體(homokaryon)。異核體的產(chǎn)生方式：①在一個(gè)多核的同核體菌絲中，其中一個(gè)細(xì)胞

核發(fā)生突變并生存下來(lái)，與野生型核一起增殖。只有當(dāng)突變的細(xì)胞核在菌絲頂端增殖時(shí)，才會(huì)使新形成的菌絲含有不同類(lèi)型的細(xì)胞核。②兩個(gè)具有不同基因型的菌株間發(fā)生菌絲接觸融合(anastomosis)，使各自細(xì)胞核進(jìn)入同一細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。不同基因型的細(xì)胞核在生長(zhǎng)的菌絲頂端增殖以產(chǎn)生穩(wěn)定的異核體。異核狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥梭w的方式：1)

產(chǎn)生只含有一種類(lèi)型細(xì)胞核的菌絲分枝；異核菌絲體偶爾可產(chǎn)生只含同一種基因型細(xì)胞核的分枝，該分枝進(jìn)一步生長(zhǎng)并產(chǎn)生更多的分枝，最終在菌落上形成一同核的扇形區(qū)域。異核狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥梭w的方式：產(chǎn)生單核的孢子。異核體在無(wú)性繁殖時(shí)若產(chǎn)生單核的孢子，則孢子萌發(fā)自動(dòng)形成同核體。如青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)，產(chǎn)孢瓶梗含一個(gè)細(xì)胞核，其分裂為瓶梗上的所有孢子提供細(xì)胞核，因此孢子萌發(fā)的菌絲體均是同核體。3、準(zhǔn)性生殖(parasexual

reproduction，parasexuality)類(lèi)似有性生殖指同種微生物不同菌株的體細(xì)胞間發(fā)生融合，不通過(guò)減數(shù)分裂發(fā)生低頻率基因重組，并產(chǎn)生重組子的生殖方式。準(zhǔn)性生殖的過(guò)程菌絲融合：在形態(tài)無(wú)區(qū)別、遺傳型有差別的同種微生物不同菌株的體細(xì)胞(單倍體)的菌絲間接觸融合。發(fā)生頻率極低。形成異核體：菌絲融合后，發(fā)生質(zhì)配，使兩個(gè)單倍體核集中到同一細(xì)胞中，形成了雙相的異核體。雜合二倍體的形成：異核體兩個(gè)不同細(xì)胞核發(fā)生核融合(核配)，產(chǎn)生雙倍體雜合子核。頻率非常低。雙倍體核一旦形成， 就會(huì)很穩(wěn)定，并分裂產(chǎn)生更多的雙倍體核。體細(xì)胞交換在有絲分裂中，雙倍體核中同源染色體間偶爾也會(huì)發(fā)生交聯(lián)，幾率也很低，但同樣會(huì)產(chǎn)生染色體重組體細(xì)胞交換即體細(xì)胞中染色體間的交換，也稱(chēng)有絲分裂交換。單倍體化：雙倍體雜合子的遺傳性狀不穩(wěn)定，進(jìn)行有絲分裂時(shí)，核內(nèi)的染色體偶爾發(fā)生交換和單倍體化，形成具有新性狀的單倍體雜合子。在雙倍體核的分裂過(guò)程中，偶爾發(fā)生染色體的非二等份分離，結(jié)果產(chǎn)生非整倍體(aneuploid)子核，一個(gè)子核含有2n+1條染色體，另一個(gè)子含有2n-1條染色體。非整倍體核是不穩(wěn)定的，在隨后的分裂過(guò)程中會(huì)丟失染色體直到回復(fù)到整倍體含2n+1條染色體的細(xì)胞核丟失一條染色體而變?yōu)?n條，含2n-1條染色體的核將逐漸回復(fù)為含n條染色體的單倍體核，從而實(shí)現(xiàn)單倍體化。3、酵母菌的遺傳酵母的特點(diǎn)：真核微生物單細(xì)胞微生物。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易進(jìn)行遺傳分析容易人工培養(yǎng)。2)

酵母的生活史釀酒酵母是以單倍體或二倍體狀態(tài)存在。3)

酵母菌的接合型遺傳釀酒酵母單倍體有a和α兩種接合型，a和α細(xì)胞的融合產(chǎn)生二倍體細(xì)胞(a/α)。單倍體酵母細(xì)胞是a型還是α型是遺傳特性所決定的，是穩(wěn)定的遺傳特征。a型 α型4)

酵母菌的2μm質(zhì)粒特點(diǎn)：為封閉環(huán)狀的dsDNA分子，周長(zhǎng)約2μm(6kb左右)，高拷貝數(shù)，每細(xì)胞含60—100個(gè)拷貝；含約600p長(zhǎng)的一對(duì)反向重復(fù)順序；在酵母細(xì)胞內(nèi)有兩種異構(gòu)體(A和B)存在；只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個(gè)蛋白質(zhì)基因

(REPl、REP2、REP3和FLP)，不賦予宿主任何遺傳表型，屬隱秘性質(zhì)粒。5)

酵母菌線(xiàn)粒體遺傳屬于細(xì)胞核外遺傳，能獨(dú)立于有絲分裂和減數(shù)分裂，稱(chēng)為細(xì)胞質(zhì)遺傳，也稱(chēng)為非孟德?tīng)栠z傳。當(dāng)接合型和線(xiàn)粒體性狀不同的兩細(xì)胞接合時(shí)，最終的表型將是細(xì)胞分裂時(shí)兩類(lèi)線(xiàn)粒體中復(fù)制快的線(xiàn)粒體的類(lèi)型。II.

酵母線(xiàn)粒體僅能編碼線(xiàn)粒體所需的少量蛋白質(zhì)。符合孟德?tīng)栠z傳不符合孟德?tīng)栠z傳，復(fù)制慢的線(xiàn)粒體丟失。思考題如果二個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記（a

-b

-c

+d

+和

a

+b

+c

-d

-）的菌株經(jīng)混合后能產(chǎn)生在基本培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的原養(yǎng)型重組菌株，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定該遺傳轉(zhuǎn)移過(guò)程是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)還是接合?

自然遺傳轉(zhuǎn)化與人工轉(zhuǎn)化之間有什么關(guān)系?為什么在一般情況下它們轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的成功率有如此大的差別?第五節(jié)微生物的育種優(yōu)良菌種選育的意義：☆為生產(chǎn)提供了各種類(lèi)型的突變株，大大提高了菌種產(chǎn)生有利用價(jià)值代謝產(chǎn)物的水平，還可以改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，去除不需要的代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物☆另外，通過(guò)菌種選育可以研究菌種的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)經(jīng)典育種方法：自然選育、誘變育種較定向的育種方法：雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程優(yōu)良菌種選育的技術(shù)手段：一、自發(fā)突變育種選育微生物在自然以10-6的突變率發(fā)生自發(fā)突變。定向培育定向培育利用微生物的自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過(guò)對(duì)微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株方法。如：卡介苗的培育二、誘變育種誘變育種是指利用誘變劑處理微生物細(xì)胞群，提高微生物的突變率，以便采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株進(jìn)行育種的方法。<一>、誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株培養(yǎng)液細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復(fù)篩

保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)純化、同步培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液，玻璃珠打散，過(guò)濾活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算變異率計(jì)算<二>、誘變育種中的原則

1、選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑化學(xué)誘變劑:N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)物理誘變劑:紫外線(xiàn)為最簡(jiǎn)便生物誘變劑:溶原性噬菌體2、挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株具優(yōu)良性狀的菌株，如生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求低等已發(fā)生過(guò)突變的菌株對(duì)誘變劑敏感性高的增變變異株3、處理單細(xì)胞或單孢子懸液容易分散，每個(gè)細(xì)胞可均勻接觸誘變劑防止長(zhǎng)出不純菌落產(chǎn)生菌落不純的原因：某些微生物細(xì)胞是多核的突變的性狀在當(dāng)代不表達(dá)產(chǎn)生表型4、選用最適的誘變劑量突變率隨劑量的增加先提高再下降。低劑量易發(fā)生正變，高劑量易出現(xiàn)負(fù)變多次誘變提高了產(chǎn)量的菌株更容易出現(xiàn)負(fù)變。5、充分利用誘變劑復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)復(fù)合處理方法同一誘變劑的重復(fù)使用兩種或多種誘變劑的先后或同時(shí)使用6、利用和創(chuàng)造與產(chǎn)量相關(guān)的指標(biāo)7、設(shè)計(jì)高效篩選方案8、創(chuàng)造新型篩選方法<三>、突變株的篩選1、產(chǎn)量突變株的篩選根據(jù)突變株的產(chǎn)物特性來(lái)確定具體的篩選方法。2、抗藥性突變株的篩選抗藥性基因是一種選擇性遺傳標(biāo)記，同時(shí)，有些抗藥菌株還是重要的生產(chǎn)菌種。梯度平板法是定向篩選抗藥性突變株的有效方法。3、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選1)

幾個(gè)概念基本培養(yǎng)基(MM)：僅能滿(mǎn)足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱(chēng)基本培養(yǎng)基。不同微生物的基本培養(yǎng)基是很不相同的。完全培養(yǎng)基(CM)：凡可滿(mǎn)足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱(chēng)完全培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)：凡只能滿(mǎn)足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生長(zhǎng)需要的組合或半組合培養(yǎng)基稱(chēng)補(bǔ)充培養(yǎng)基。2)營(yíng)養(yǎng)缺