生物信息學與pcr課件

第九章聚合酶鏈反應

（PolymeraseChainReaction.PCR）評價：

*PCR是現(xiàn)今生物生命學科最關注、最愛用、

最歡迎的新技術。

*被譽為：20世紀80年代出現(xiàn)的具有劃時代

的、生命學科中革命性的新技術。

*PCR使生命學科發(fā)生變革，給生物醫(yī)學的發(fā)

展注入無限活力。

*公認PCR最具發(fā)展前景，最有生命力的一項

新技術。

*最短時間獲諾貝爾獎（86-93年）。

*多么高的評價都不過分。一、問題提出

背景:

分子生物學、遺傳學的興起，

反向生物學的誕生

（核酸、遺傳物質(zhì)，基因型→表型）。

共同障礙：

如何在短時間內(nèi)快速、獲足夠量、純凈的、

特異的目的DNA片段/基因供使用，可檢測。

1．基礎理論研究的需要

DNA重組、基因克隆、HGP測序，探針制備

2．實際應用的需要

基因工程（基因表達）、基因診斷、基因治

療，基因預防等給人類帶來希望。體內(nèi)DNA的復制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓撲異構酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’3’Mullis的PCR構思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段二、PCR的基本概念概念由一對引物介導，在體外對特定DNA片段進行快速、酶促、擴增技術。以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。PCR反應循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸前提：人工合成一對特定引物作向導，始動DNA合成。酶促：體外試管內(nèi)進行酶促生化合成（非化學合成）。靶子：特導擴增目的靶序列（目的）。高效：極微量模板、百萬倍擴增快速：短時高速完成實驗。內(nèi)涵：

三、PCR工作原理

PCR的基本原理

變性、復性、半保留復制

PCR過程：3步曲+1循環(huán)

高溫變性90～97℃降溫退火45～55℃適溫延伸72℃左右反復循環(huán)

分四個階段講述其原理：

（一）高溫模板變性

制備好含有擴增靶序列/目的基因的樣品DNA

（模板DNA）。然后在高溫下（90-95℃）使雙

鍵模板DNA變性，解鏈，獲得單鏈模板DNA，為DNA

合成作好準備。

（二）降溫引物退火

合成一對特導性引物，在25-55℃溫度下，

引物與模板配對結合。引物的作用有三：定位、定向、定大小1．定位：

①一對引物分別位不同模板

DNA鏈上的靶序列的兩端，

②兩條引物各自結合在不同

的信息、非信息鏈上。

③引物是通過嚴格堿基互補發(fā)揮識別、結合和特異定位。

2．定向：

DNA鏈有方向性從5′端到3′端，引物

結合也有方向性。

①引物和模板DNA3′端結合，

②以引物為起點的新合成鏈，5′端鎖定。

遵循DNA合成5′端到3′端的方向性，

引物只能3′端延伸，

③兩條引物3′端均指向靶序列。

在高溫模板變性反應體系中，加入過量（濃度大，引物數(shù)量多）的一對引物，在較低溫下（25-50℃）大量的引物分別與各自相對應的單鏈模板DNA互補補嚴格大堿基配對，由于引物量大，長度小，其退火、結合的速度遠高于模板單鏈DNA之間的結合。3．定大小

引物決定兩條引物之間的靶序列長度，一對引物一旦設計合成，其擴產(chǎn)物長短不再變化。（三）適溫引物延伸（適溫新鏈合成）

加入選定的DNA聚合酶，在其適宜溫度（Taq酶為65-72℃）進行DNA酶促合成反應，反應體系中的4×dNTP（底物A、C、G、T四種核酸），在引物3′端，在模板序列指導下，開始合成，即引物自5′→3′端延伸，合成一條與模板互補之新鏈。

反應體系中DNA產(chǎn)量增加一倍，（原模板+新合成DNA，半保留復制），若以此產(chǎn)物DNA總量為模板重新合成反應，新反應體系中模板量實際將增加一倍。（四）循環(huán)指數(shù)擴增

重復前三個步驟，

由于每次循環(huán)后產(chǎn)物可作為下一次反應模板，DNA總量和模板量均較上一次循環(huán)增加一倍，

反復多次累積呈指數(shù)增加，如一分子DNA成單鏈后兩個模板，一次循環(huán)后變?yōu)?分子DNA，變性后有4個單鏈模板，30次循環(huán)的230呈百萬倍增加。PCR原理模版目的擴增片段5’5’3’3’PCR原理１高溫模板變性目的擴增片段3’3’5’5’PCR原理2.降溫引物退火上游引物：下游引物：5’3’3’5’PCR原理3.適溫引物延伸PCR原理4.循環(huán)指數(shù)擴增１)高溫模板變性PCR原理2)降溫引物退火PCR原理3)適溫引物延伸PCR原理4)循環(huán)指數(shù)擴增(1)高溫模板變性PCR原理(2)降溫引物退火PCR原理(4)循環(huán)指數(shù)擴增(3)適溫引物延伸

DNA以指數(shù)形式擴增(2n)，其中長片段以線性形式擴增(2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引物之間。預變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復性(40-60C,30s)延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72C,7m)(25-35)次PCR的一般過程：經(jīng)過30次的循環(huán),擴增的DNA片段可達100萬倍以上。24016256７11452228200短片段（單鏈）1412108642長片段（單鏈）128643216８４２總片段（單鏈）６５４３２１０循環(huán)數(shù)PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列BiotinBiotin第1個PCR循環(huán)完成后

得到兩個拷貝的靶序列No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量

PCR每次循環(huán)擴增一覽表(n≠0)循環(huán)起始模板5′端鎖定長鏈短鏈靶序列總拷貝數(shù)

02 0 0 2 1 2 2 0 4 2 2 4 28 3 2 6 8 16 4 2 8 22 32 ……………………20 2 40 105 220+1

n 2 2n 2n+1-2n-22n+1

(恒定不變) (線性增加)(近似指數(shù)增加)(指數(shù)增加)

從表中可知，

20次PCR循環(huán)后，反應產(chǎn)物DNA鏈拷貝數(shù)220起始模板可略去不計，5′端長鏈數(shù)40個，只占總數(shù)40/220≈3.5×10-5.比例相當小。當擴增30次后，其占比例更小，產(chǎn)物中99.99%均為目的靶序列短鏈?？赡芎铣缮倭啃∮诎行蛄械亩绦∑巍Ｓ捎谶M入下一循環(huán)后，引物結合不止，不可能大量擴增。(二)PCR操作流程加酶后參數(shù)時間溫度變性30″(＜1m）90-95℃退火30″-60″37-55℃擴增60″-90″70-75℃循環(huán)總次數(shù)25-30次

5、PCR反應參數(shù)的設定（選擇與優(yōu)化）

PCR反應體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶PfuDNA多聚酶引物和或和*切記莫忘

模板變性要充分，最好加酶前使模板充分變性

變性成單鏈*PCR反應六要素

引物酶dNTP模板Mg2+緩沖液（四）結果檢測（顯示）一般采用瓊脂礦凝膠電泳-澳化乙錠處理——紫外燈下觀察法、熒光顯示（PCR-EB法）注意設立嚴格對照：①DNA分子量標準，②陽性對照，③陰性、空白對照更精確的方法：

①PCR-blot（轉印后與已知探針、雜交）②PCR-LP（產(chǎn)物標記后作探針、雜交）③PCR-HPLC（分析吸收峰）④套式PCR（另設計一對內(nèi)引物、擴增更小片段）標記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物五、PCR兩個最關鍵因素——引物、酶（一）引物引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應需要兩種引物，分別成為5′端引物和3’端引物，或稱為上游/正向引物和下游/反向引物。通常DNA及mRNA序列的寫法為5′→3′，所以5′端引物與目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物與目的序列的3′末端序列反向互補。引物它們作為DNA擴增的起始部分，能限定待擴增DNA序列的長度。為了保證擴增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應至少有15～18bp。5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物*如何設計PCR引物——要素之一（A）引物來源：（1)購買成套檢測試劑盒，簡單省力、易出錯、成本高（2)自己合成1）查文獻、查序列庫（計算機）①直接查引物序列→合成；②查靶序列自己設計2）依PCR目的，選定靶序列上的兩側翼序列如作檢測，靶序列應保守、特異（種、屬、型特異）

3）必須有兩條不同引物，擴增兩條不同鏈，序列分析資料只能提供一個DNA鏈順序。假定是信息鏈的資料。5′P2←3′3→P15′

信息鏈5′3′，

已知該條信息鏈序列/靶序列資料：5’-TATAAC……ATGAAGACGAGCCAC……//…CAGCGG………//………CACCGACTCCATTAA……CGTACG-3′必須據(jù)此序列置設兩個引物：①擴增信息鏈的引物②擴增其互補鏈的引物(知道DNA一條鏈序列，可依鹼基互補配對原則寫出另一互補鏈序列）

（4）誰的引物合成誰的鏈，但必須以對方鏈為模板，產(chǎn)物中的兩條新鏈，一條是信息鏈，另一條為與互補的非信息鏈。（5）信息鏈引物的設計：按信息鏈順序，在5′分端選定部位，按堿基排列順序照抄10-20個堿基，即信息鏈引物。合成新的信息鏈。信息鏈引物：P15′ATGAAGACGAGCCAC（5′→3′）見圖

（6）非信息鏈引物的設計在信息鏈的3′端，選10-20堿基，寫出其互補堿基，即為非信息鏈引物，將來以互補鏈為模板合成出新的非信息鏈，考慮到方向性。（5′→3′）非信息鏈引物：P25′—TTAATGGAGTCGGTG—3′即按5′→3′寫出，（表面上與信息鏈順序反向）

3′

5′P25′—TATAAC…ATGAAGACGAGCCAC/////CACCGACTCCAGTTAA—3′3′—ATATTG…TACTTCTGCTCGGTG/////GTGGCTGAGGTAATT—5′P15′3′

P15′ATGAAGACGAGCCAC3′（5′→3′）P25′TTAATGGAGTCGGTG3′（5′→3′）（7）利用生物信息學計算機網(wǎng)絡分析DNAsis軟件。（配對情況及設計合理性）（8）合成與純化（B）設計引物十大原則

引物的設計在PCR中很重要。（三定作用）總體考慮：

特異性、高效擴增和自由度廣泛應用①長度：15-35堿基(mer，nt)最好20-25nt。過短：特異性降低，結合不牢過長：成本高，特異性反而降低（不易結合）②堿基組成：引物中四種堿基的分布最好是隨機，G+C含量50%或與目的片段相當。G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。③引物內(nèi)部不應有二級結構，避開產(chǎn)物的二級結構區(qū)。影響配對。④引物之間特別是引物的兩端之間不能有互補的序列，減少引物形成“模板”，導致二聚體出現(xiàn)。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。⑤引物3′端必須確保嚴格與目的片段互補，不能進行任何修飾，不能發(fā)生錯配。

特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、?′端未位堿其少選A。以T.C.G為好。減少錯配，避免引物不能延伸。另外3′端最好選保守的三個堿基序列（如保守的aa密碼）

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

⑦擴增目的片段的長度。

引物擴增跨度：以200-500bp最好，1kb以下為宜。3kb＞3kb效率大大下去降,也能擴增10kb以上（困難）⑧所用引物濃度

引物純度最好達PAGE電泳純、HPLC純。引物濃度0.1-0.5-1μmol/L或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會

兩引物濃度為1:1⑨引物5′端具包容性，可容忍不配對序列存在，據(jù)此可按需設計附加序列。

此附加序列配對時開始5′端游離，以后因已進入產(chǎn)物序列，便可擴增，如插入酶切位點，調(diào)控元件，等。⑩密碼子的簡并如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：①引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級結構。③引物長度一般在15-30堿基之間。④G+C含量在40%-60%之間。⑤堿基要隨機分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。

*

酶及其濃度——要素之二：

DNA聚合酶酶是PCR成功與否的另一關鍵因素(詳見后進展一節(jié)).它決定了：①酶促反應能否進行；②特異性催化(反應、校對)；③效率；④速度常用的TaqDNA聚合酶從棲熱水生桿菌中提純的天然酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則