高效液相色譜法中文

高效液相色譜法中文第1頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月第十八章高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography;HPLC）18.1

概論一、定義以液體為流動相的色譜法稱之為液相色譜法第2頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

采用普通規(guī)格的固定相及流動相，常壓輸送的液相色譜法為經(jīng)典液相色譜法。以經(jīng)典液相色譜法為基礎，引入了氣相色譜的理論與實驗方法，流動相改為高壓輸送，采用高效固定相及在線檢測手段，發(fā)展而成的分離分析方法叫高效液相色譜法。該法具有分離效能高，分析速度快及儀器化等特點，因此稱之為高效液相色譜法。第3頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月HPLC①能制成溶液的樣品②80％的有機化合物③分子量大的高分子化合物及離子型都能測定二、高效液相色譜法與氣相色譜法應用范圍對比GC①能汽化的樣品②20％的有機化合物③揮發(fā)性差和熱不穩(wěn)定的樣品不能測第4頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月三、高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法區(qū)別第5頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月一、HPLC的主要類型18.2高效液相色譜法的主要類型與原理第6頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

以化學鍵合相為固定相的色譜法稱之為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法。（bondedphasechromatography，BPC）

二、化學鍵合相色譜法第7頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

根據(jù)化學鍵合相與流動相極性的相對強弱，鍵合相色譜法可分為正相(normalphase;NP)和反相(reversedphase;RP)鍵合相色譜法。第8頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）正相鍵合相色譜法

固定相的極性大于流動相的極性。

固定相－氨丙基、氰丙基

流動相－以正己烷為底劑，加入極性調節(jié)劑。第9頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

氰基鍵合相：

其分離選擇性與硅膠相似，但極性小于硅膠，所以，流動相和其他色譜條件都相同的條件下，同一組分的保留時間將小于硅膠。許多用硅膠柱分離的課題，可用氰基鍵合相柱完成。

第10頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

氨基鍵合相:與硅膠的性質有較大差異，前者為堿性，后者為酸性。在做正相洗脫時，表現(xiàn)出不同的選擇性。氨基鍵合相色譜柱是分析糖類最主要的色譜柱，也稱為碳水化合物柱。

第11頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月1.分離機制主要是范德華作用力，誘導作用力或氫鍵作用力。例如：用氨基鍵合相分離極性化合物（如糖類）時，主要根據(jù)被分離組分分子與鍵合相的氫鍵作用力的強弱差別而分離的。第12頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月2.流動相的極性與保留因子的關系極性強的組分的保留因子k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，tR

減??；反之，k增大，tR增大。第13頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

固定相——十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等化學鍵合相，有時也用弱極性或中等極性的鍵合相為固定相。流動相——以水作為基礎溶劑再加入一定量與水混溶的極性調整劑，常用甲醇－水、乙腈－水等。（一）反相鍵合相色譜法固定相的極性比流動相的極性弱。第14頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月2.流動相的極性與保留因子的關系極性強的組分的保留因子k小，先洗脫出柱。流動相的極性增強，洗脫能力減弱，使組分k增大，tR

增大；反之，k減小，tR減小。第15頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）離子對色譜法（pairedionchromatography,PIC或ionpairchromatography,IPC）正相離子對色譜法和反相離子對色譜法第16頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月反相離子對色譜法(RP-ionpairchromatography)

是把離子對試劑加入到含水流動相中，被分析的組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（或稱對離子，counterion）生成不荷電的中性離子對，從而增加溶質與非極性固定相的作用，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。用于分離可離子化或離子型的化合物。第17頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月1.分離機制以RPIC分離堿類物質為例，用離子對模式說明分離機制。

第18頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

RPIC的出柱順序與RHPLC一致。

RPIC是在藥物分析中應用很廣，如生物堿、有機酸、磺胺類藥物，某些抗生素和維生素等。第19頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatography,ISC）在反相色譜法中，通過調節(jié)流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術稱為離子抑制色譜法。第20頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月1.適用范圍

3.0≤pKa≤7.0的弱酸

7.0≤pKa≤8.0的弱堿2.影響保留因子的因素除與反相色譜法有相同的影響因素外，主要還受流動相的pH值的影響。第21頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

對于弱酸，當流動相的pH＜pKa時，組分以分子形式為主，k值增大，tR增大；

pH＞pKa，組分以離子形式為主，k值變小，tR減小

對于弱堿，情況相反第22頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月一、化學鍵合相色譜法的固定相

按照所鍵合基團的極性可將其分為非極性﹑弱極性和極性三類。

（一）鍵合相的種類

18.2HPLC的固定相流動相及其選擇第23頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月1．非極性鍵合相如十八烷基（C18）﹑辛烷基（C8）﹑甲基（C1）與苯基等。十八烷基硅烷(octadecylsilane，ODS或C18)鍵合相是最常用的非極性鍵合相。它是由十八烷基硅烷試劑與硅膠表面的硅醇基經(jīng)多步反應生成的鍵合相。非極性鍵合相通常用于反相色譜。第24頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

非極性鍵和相的烷基鏈長對溶質的保留、選擇性和載樣量都有影響。長鏈烷基可使溶質的k增大，分離選擇性改善，使載樣量增加，長鏈烷基鍵合相的穩(wěn)定性好。短鏈非極性鍵和相的分離速度較快，對于極性化合物可得到對稱性較好的色譜峰。第25頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

2．弱極性鍵合固定相

常見的有醚基和二羥基鍵合相。這種鍵合相可作為正相或反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。這類固定相應用較少。第26頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

3．極性鍵合相常用氨基﹑氰基鍵合相，是分別將氨丙硅烷基（≡Si(CH2)3NH2）及氰乙硅烷基(≡Si(CH2)2CN)鍵合在硅膠上制成。它們一般都用作正相色譜的固定相，但有時也用于反相色譜。第27頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月二、化學鍵合相色譜法的流動相HPLC對流動相的基本要求：①化學穩(wěn)定性好，不與固定相發(fā)生化學反應。②對試樣有適宜的溶解度。要求使k在1~10范圍內，最好在2~5的范圍內。③必須與檢測器相適應。例如用紫外檢測器時，只能選用截止波長小于檢測波長的溶劑。④純度要高，黏度要小。低黏度流動相如甲醇﹑乙睛等可以降低柱壓，提高柱效。第28頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

截止波長:用1cm光徑的吸收池裝溶劑，用空氣為參比，改變照射波長，當吸光度A＝1

時，此時的波長稱為該溶劑的截止波長。如：水190nm，甲醇205nm，乙腈190nm第29頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)流動相對分離的影響n由固定相及色譜柱填充質量決定，α主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。第30頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

因為不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，有可能使被分離的兩個組分的分配系數(shù)不等，即α≠1。改變流動相中各種溶劑的配比，能改變其洗脫能力，組分的k也改變。在正相色譜法中，增加流動相中強溶劑的比例，其洗脫能力增強，使k變小。第31頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

流動相的極性可用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P′來表示。

Snyder選擇了三種參考物質，乙醇（質子給予體），二氧六環(huán)（質子受體）和硝基甲烷（強偶極體）用來檢驗溶劑的質子接受能力（Xe），給予質子能力（Xd）和偶極作用力（Xn）。（三）溶劑的強度和選擇性1．溶劑的極性和強度

第32頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

Snyder提出的溶劑極性參數(shù)是根據(jù)羅胥那德（Rohrschneider）的溶解度數(shù)據(jù)推導出來的，將羅氏提供的極性分配系數(shù)()以對數(shù)的形式表示。純溶劑的極性參數(shù)(P')定義為：

P'值越大，則溶劑的極性越大，在正相色譜中的洗脫能力越強。第33頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月表20-1

常用溶劑的極性參數(shù)P'和選擇性參數(shù)溶劑P'XeXdXn溶劑P'XeXdXn正戊烷0.0———乙醇4.30.520.190.29正己烷0.1———醋酸乙酯4.40.340.230.43苯2.70.230.320.45丙酮5.10.350.230.42乙醚2.80.530.130.34甲醇5.10.480.220.31二氯甲烷3.10.290.180.53乙腈5.80.310.270.42正丙醇4.00.530.210.26醋酸6.00.390.310.30四氫呋喃4.00.380.200.42水10.20.370.370.25氯仿4.10.250.410.33第34頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月反相鍵合相色譜法的溶劑強度常用

S表示常用溶劑的S值列于表20-2

在正、反相色譜法中，溶劑的洗脫能力大體相反。例如，在正相洗脫時，水的洗脫能力最強（P'最大，為10.2），而在反相洗脫時，水的洗脫能力最弱（S最小，為0）。第35頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

表20-2反相色譜常用溶劑的強度因子（S）水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃03.03.23.43.53.64.24.5第36頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月2．混合溶劑的強度

用于正相鍵合相色譜法的多元混合溶劑的強度，用極性參數(shù)來表示，其值為各組成溶劑極性參數(shù)的加權和：——純溶劑i的極性參數(shù)

i——該溶劑在混合溶劑中的體積分數(shù)。

第37頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

反相色譜法的混合溶劑的強度因子用類似方法計算：第38頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分離條件的選擇(一)高效液相色譜法中的速率理論

1．渦流擴散

A=2λdp

為了降低渦流擴散的影響，HPLC中一般使用3~10μm的小顆粒固定相，目前有2μm以下的固定相。為了填充均勻，減小填充不規(guī)則因子，常采用球形固定相，而且要求粒度均勻（RSD＜5%）。此外，HPLC色譜柱以勻漿高壓填充。第39頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

2．縱向擴散

Dm

與流動相的黏度（η）成反比，與溫度成正比。在HPLC中，流動相是液體，其黏度比氣體黏度大得多（約102倍），而且常在室溫下進行操作，因此組分在流動相中的擴散系數(shù)Dm比氣相色譜的要小得多（為105倍左右）。而且HPLC的流速一般都在最佳流速以上，這時縱向擴散項很小，可以忽略。第40頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

第41頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）固定相傳質阻抗通常采用化學鍵合相，它的“固定液”是鍵合在載體表面固定液官能團的單分子層，所以，固定液的傳質阻抗可以忽略，于是

C=Cm+Csm3．傳質阻抗

C=Cm+Csm+Cs第42頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）流動相傳質阻抗

在一個流路中處于流路中心的分子和處于流路邊緣的分子與固定相的作用力不同，遷移速率不同，處于流路邊緣的分子與固定相的作用力大于處于流路中心的分子，遷移速率相對慢于處于流路中心的分子，因而使峰變寬。第43頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）靜態(tài)流動相傳質阻抗由于固定相是多孔性的，使部分流動相滯留在固定相微孔內部。靜態(tài)流動相傳質阻抗是分子進入處于固定相較深孔穴內的靜止流動相中，而晚回到流動相而引起峰展寬。

于是HPLC中的VanDeemter

方程式為：

H=A+Cmu+Csmu第44頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）鍵合相色譜法的分離條件1.固定相的選擇（1）正相鍵合相色譜法一般以極性鍵合相為固定相如氰基、氨基鍵合相

第45頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些基團化合物如甾體，強心苷等有較好的分離能力。氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，所以廣泛用于糖類的分析。

氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性；第46頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）反相鍵合相色譜法

在反相鍵合相色譜、反相離子抑制色譜及反相離子對色譜中，常選用非極性鍵合相，非極性鍵合相可用于分離分子型化合物，也可用于分離離子型或可離子化的化合物。

ODS是應用最廣泛的非極性固定相。對于各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，苯基鍵合相適用于分離芳香化合物以及多羥基化合物如黃酮苷類等。第47頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月2.流動相的選擇

(1)正相色譜法以正己烷為底劑，加入極性調節(jié)劑

第48頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

例如，正己烷與異丙醚(Ⅰ)組成的二元流動相，通過調節(jié)極性調節(jié)劑異丙醚的濃度來改變溶劑強度Pˊ，使樣品組分的k值在1-10范圍內。若溶劑的選擇性不好，可以改用其它組別的強溶劑如氯仿（Ⅷ）或二氯甲烷（Ⅴ），與正己烷組成具有相似Pˊ值的二元流動相，若仍難以達到所需的分離選擇性，還可以使用三元或四元溶劑體系。第49頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）反相色譜法以極性最強的水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調節(jié)劑。極性調節(jié)劑的性質以及其與水的混合比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。

但乙腈的溶劑強度高且粘度小，并可滿足在紫外185-205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈－水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)。第50頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）反相離子抑制色譜在反相鍵合相色譜法中加入少量的弱酸（常用HAc）、弱堿（氨水）或緩沖鹽（磷酸鹽及醋酸鹽），調節(jié)流動相的pH值，以抑制組分分子的自身解離，并改善峰形。在進行離子抑制色譜時，流動相的pH需在2-8之間，超出此范圍可能損壞鍵合相。第51頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

在反相離子對色譜法中，影響試樣組分的保留值和分離選擇性的主要因素有離子對試劑的性質和濃度、流動相的pH以及流動相中所含有機溶劑的種類和比例等。（4）反相離子對色譜法第52頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

（1）離子對試劑的選擇離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反。分析酸類或帶負電荷的物質時，常用季銨鹽作離子對試劑；分析堿類或帶正電荷的物質時，常用烷基磺酸鹽（或硫酸鹽）作離子對試劑。離子對試劑的濃度一般在3~10mmol/L。第53頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）流動相pH的選擇：

由于離子對的生成依賴于試樣組分的解離程度，當試樣組分與離子對試劑全部離子化時，最有利于離子對的形成，組分的

k值最大。因此，調節(jié)pH可在較大范圍內改變弱酸或弱堿試樣的保留值和分離選擇性。流動相在pH2-8范圍內。第54頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）有機溶劑及其濃度的選擇

在反相離子對色譜法中，甲醇－水或乙腈－水系統(tǒng)是常用的流動相，流動相中所含有機溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般來說，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強，所需有機溶劑的比例越高。第55頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)洗脫方法1.等度洗脫（isocraticelution）等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定。

適用于組分數(shù)目較少、性質差別不大的試樣分離。第56頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制改變流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等。分析組分數(shù)目多、性質相差較大的復雜試樣時須采用梯度洗脫技術，使所有組分都在適宜條件下獲得分離。2.梯度洗脫（gradientelution）

梯度洗脫能縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度；但是可能引起基線漂移和重現(xiàn)性降低。第57頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月18.3高效液相色譜儀HPLC裝置輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進樣系統(tǒng)第58頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月高效液相色譜儀示意圖第59頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月一、輸液系統(tǒng)(一)高壓輸液泵送液

輸液泵應具備如下性能：①流量精度高且穩(wěn)定，其RSD應小于0.5%，這對定性定量準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100ml/min；③能在高壓下連續(xù)工作；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。第60頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月プランジャー型のポンプで送液の模式図第61頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）梯度洗脫裝置

實現(xiàn)梯度洗脫的裝置，即高壓梯度和低壓梯度。高壓二元梯度裝置是由兩臺高壓輸液泵分別將兩種溶劑送入混合室，混合后送入色譜柱，程序控制每臺泵的輸出量就能獲得各種形式的梯度曲線。低壓梯度裝置是在常壓下通過一比例閥先將各種溶劑按程序混合，然后再用一臺高壓輸液泵送入色譜柱。第62頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月

梯度洗脫裝置第63頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月二、分離和進樣系統(tǒng)（一）進樣器進樣閥和自動進樣裝置兩種一般高效液相色譜分析常用六通進樣閥，大數(shù)量試樣的常規(guī)分析往往需要自動進樣裝置。第64頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月六通閥進樣裝置第65頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）色譜柱

1.色譜柱的構造按主要用途分為分析型和制備型，常規(guī)分析柱內徑2~5mm，柱長10~30cm；窄徑柱(narrowborecolumn)內徑1~2mm，柱長10~20cm；毛細管柱內徑0.2~0.5mm。實驗室制備柱內徑20~40mm，柱長10~30cm，生產(chǎn)用的制備型色譜柱內徑可達幾十厘米。第66頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月2．色譜柱的性能評價

無論自己填裝的色譜柱還是購買的商品柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件（試樣、流動相、流速、溫度）下的柱壓、塔板高度H和板數(shù)n、對稱因子fs、保留因子k和分離因子α的重復性或分離度R。第67頁，課件共77頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜柱性能考察常用的試樣和流動相介紹如下：(1)硅膠柱：苯、萘和聯(lián)苯為試樣；無水己烷或庚烷為流動相。(2)烴基鍵合相柱：尿嘧啶(k=0)、硝基苯、萘和芴為試樣；甲醇－水(85:15)或乙腈－水(6