實(shí)驗(yàn)室核酸制備的常用方法教學(xué)課件

提綱基因組DNA的分離與純化RNA的分離與純化DNA的分離與純化DNAisolationandpurification提取DNA總的原則:■保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度;■核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子;口其他核酸分子,如RNA,也應(yīng)盡量去除。二、樣本來源理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜翘崛∪蚪MDNA最常見的樣本血清、血漿、外周血有核細(xì)胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織(包括骨髓)和羊水等都是分子診斷的檢驗(yàn)材料,其中全血、血漿(血清)標(biāo)本占分子診斷的60%以上生物組織:最好新鮮組織,若不能馬上提取,應(yīng)貯存70℃或液氮、樣本采集、預(yù)處理和保存)全血抗凝劑:EDTA-Na2或枸櫞酸鈉作為抗凝劑,不宜使用肝素抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA%80℃保存2個(gè)月,第10天收率90%第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%提取效果差第四天收率90第十天提取效果差二)血漿和血清血漿和血清是檢測(cè)釋放入血的游離核酸最主要的標(biāo)本來源,用來檢測(cè)病毒、細(xì)菌,以及腫瘤細(xì)胞等釋放出來的游離核酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物,在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原微生物和腫瘤標(biāo)志基因的檢測(cè)中血漿DNA又稱為循環(huán)DNA,是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA,主要是游離的單鏈、雙鏈DNA或DNA蛋白質(zhì)的混合物,它在未來分子診斷的應(yīng)用中具有廣闊前景血漿DNA成分的來源分為內(nèi)源性和外源性兩個(gè)部分,其中入侵的病毒、細(xì)菌等病原體釋放入血液的核酸是外源性血漿DNA最重要的成分血漿DNA內(nèi)源性循環(huán)DNA外源性循環(huán)DNA自身基因組來源DNA入侵的病毒、細(xì)菌等病原體死亡細(xì)胞活細(xì)胞釋放三)體液■尿液、胸水、腹水和腦脊液等標(biāo)本離心后取沉淀提取體液中細(xì)胞的核酸■對(duì)釋放入體液中的病毒或細(xì)菌的游離核酸,采用超高速離心或體液濃縮后再提取核酸(四)分泌物(以痰液為例)■痰液是檢測(cè)呼吸道病原體核酸的主要樣本,深部咳痰,患者采集早晨起床后的第一口痰,采集前應(yīng)先漱口,以避免混入大量的口腔脫落的上皮細(xì)胞和唾液等影響檢測(cè)結(jié)果結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè),可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白質(zhì);非結(jié)核分枝桿菌的核酸,使用生理鹽水后取上清液痰液檢測(cè)病原體核酸不適宜作定量分析,檢測(cè)時(shí)盡可能提高痰液中細(xì)胞成分的回收率四、DNA提取的基本步驟機(jī)械法與非機(jī)械法(非機(jī)械法中溶胞法