實(shí)驗(yàn) 紫外可見與分子熒光光譜

實(shí)驗(yàn)紫外可見與分子熒光光譜第1頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月目錄一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理1紫外-可見光譜基本原理2分子熒光光譜基本原理3儀器結(jié)構(gòu)三儀器和試劑實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1有機(jī)化合物紫外吸收光譜及溶劑效應(yīng)2硫酸奎寧激發(fā)、發(fā)射光譜測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析數(shù)據(jù)記錄與結(jié)果分析思考題第2頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握紫外－可見分光光度法和分子熒光的分析原理，了解兩者的區(qū)別與聯(lián)系2．熟悉紫外－可見分光光度計(jì)和分子熒光的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)，掌握其操作使用方法。3．掌握苯及其衍生物的紫外吸收光譜及其鑒定方法，以及溶劑極性對(duì)紫外吸收光譜的影響。4.掌握分子熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的概念和測(cè)定方法，及標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定硫酸奎寧含量的方法。5.掌握Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)畫圖及圖譜處理第3頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月1紫外-可見光譜基本原理

電子從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，此時(shí)電子就吸收了相應(yīng)波長(zhǎng)的光，這樣產(chǎn)生的吸收光譜叫紫外光譜。

分子中電子能級(jí)躍遷的光波波長(zhǎng)范圍為10～800nm其中:10～190nm：遠(yuǎn)紫外區(qū)--真空紫外區(qū)；190～400nm：近紫外區(qū)，又稱紫外光區(qū)；400～800nm：可見光區(qū)。第4頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月*

*n*n***n第5頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月n→π﹡遠(yuǎn)紫外近紫外可見光

σ→σ*遠(yuǎn)紫外10-200nmn→σ*紫外-可見200-250nmn→π*紫外-可見200-400nmπ→π*遠(yuǎn)紫外-紫外150-700nm飽和烴б鍵電子躍遷，它需要的能量較高，一般發(fā)生在真空紫外光區(qū)，飽和烴的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可見分光光度計(jì)的測(cè)量范圍。例如甲烷的λmax為135nm。不飽和烴類和共軛體系，它需要的能量低于б-б*的躍遷，吸收峰一般處于近紫外光區(qū)，在200nm左右。其特征是摩爾吸光系數(shù)大，一般εmax>104為強(qiáng)吸收帶。如乙烯(蒸氣)的最大吸收波長(zhǎng)λmax為162nm。

在不飽和烴類分子中，當(dāng)有兩個(gè)以上的雙鍵共軛時(shí)，隨著共軛系統(tǒng)的延長(zhǎng)，π→π*躍遷的吸收帶將明顯向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在共軛體系中，π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶又稱為K帶。雜原子不飽和基團(tuán)，這類躍遷發(fā)生在近紫外光區(qū)和可見光區(qū)，其特點(diǎn)是譜帶強(qiáng)度弱，摩爾吸光系數(shù)小，通常小于100，屬于禁阻躍遷。有機(jī)化合物中的H被雜原子取代后，實(shí)現(xiàn)這類躍遷所需要的能量較高，比σ→σ*躍遷所需的能量少，吸收光譜的波長(zhǎng)一般在150—250nm處。其吸收光譜落于遠(yuǎn)紫外光區(qū)和近紫外光區(qū)，例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n→σ*躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。這些數(shù)據(jù)說明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，顯示了助色團(tuán)的助色作用第6頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月

直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實(shí)用價(jià)值不大。但是它們是測(cè)定紫外和可見吸收光譜的良好溶劑。紫外光譜只能觀察π-π*和n-π*躍遷。也就是說紫外光譜只適用于分析分子中具有不飽和結(jié)構(gòu)的化合物。能測(cè)試不飽和共軛雙鍵的化合物、芳香族化合物和過度金屬離子。根據(jù)吸收的波長(zhǎng)，推斷是什么價(jià)電子躍遷，從而判定分子結(jié)構(gòu)骨架、配合紅外光譜法、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法等進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析，它是一種有用的輔助手段。紫外吸收光譜雖然不能對(duì)一種化合物作出準(zhǔn)確鑒定，但對(duì)化合物中官能團(tuán)和共軛體系的推測(cè)與確定卻非常有效。結(jié)構(gòu)完全相同的化合物應(yīng)有相同紫外譜圖，但譜圖相同的卻不一定是同種化合物。將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測(cè)定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)完全一致。如果沒有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照進(jìn)行比較。這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測(cè)定條件要相同。第7頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外光譜圖及表示方法或lg

nm橫坐標(biāo)：波長(zhǎng)λ（nm）縱坐標(biāo)：A,T,1-T,,log,核心三要素：吸收峰位置吸收強(qiáng)度形狀第8頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月

苯：E1帶:180184nm=47000E2帶:200204nm=7000E帶：苯環(huán)上三個(gè)共扼雙鍵→*躍遷特征吸收帶B帶:→*與苯環(huán)振動(dòng)引起230-270nm=200

含取代基時(shí)，B帶簡(jiǎn)化，紅移。苯及苯環(huán)上不同取代基對(duì)紫外光譜的影響第9頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外光譜的溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng)：在不同溶劑中譜帶產(chǎn)生的位移。受溶劑的極性或酸堿性的影響，使溶質(zhì)吸收峰的波長(zhǎng)、強(qiáng)度以及形狀發(fā)生不同程度的變化

溶劑選擇的原則：

1、不與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)2、所選溶劑在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無明顯吸收。3、對(duì)被測(cè)組分有較好的溶解能力4、被測(cè)組分在所選的溶劑中有較好的峰形第10頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月極性溶劑中紫外吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)完全消失

第11頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月EnEpEnEp**n*n*

*躍遷n*

躍遷非極性溶劑極性溶劑非極性溶劑極性溶劑

л-л*:基態(tài)的極性小于激發(fā)態(tài)的極性，極性溶劑與激發(fā)態(tài)間相互作用(穩(wěn)定作用)大于基態(tài),導(dǎo)致極性溶劑中△Ep降低,λmax向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。n-л*:非成鍵n電子與極性溶劑相互作用形成氫鍵,極性溶劑與基態(tài)間相互作用(穩(wěn)定作用)大于激發(fā)態(tài)態(tài)降低了基態(tài)的,導(dǎo)致極性溶劑中△Ep>△En,λmax向短波方向移動(dòng)*躍遷，溶劑極性增加，吸收紅移。n*躍遷，溶劑極性增加，吸收藍(lán)移。

第12頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月溶劑效應(yīng)對(duì)丙酮紫外吸收的影響1-己烷2-95%乙醇3-水

第13頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月2分子熒光光譜基本原理

除紫外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光等熒光:電子從被激發(fā)到單基態(tài)S1躍遷到基態(tài)S0所發(fā)出的光

第14頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月

激發(fā)譜和發(fā)射譜

激發(fā)譜是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下測(cè)得的某一波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化情況，也就是不同波長(zhǎng)的激發(fā)光的相對(duì)效率；發(fā)射譜則是某一固定波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下熒光強(qiáng)度在不同波長(zhǎng)處的分布情況，也就是熒光中不同波長(zhǎng)的光成分的相對(duì)強(qiáng)度。激發(fā)譜和吸收譜極為相似，呈正相關(guān)關(guān)系吸收譜與發(fā)射譜呈鏡象對(duì)稱關(guān)系?；鶓B(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似第15頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的定量分析在稀溶液中，熒光強(qiáng)度F與物質(zhì)濃度c有以下關(guān)系：F＝2.3KφεbcI0＝2.3KφAI0，當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度一定，且濃度很小時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比，即F=Kc。這是熒光光譜法定量分析的依據(jù)。此關(guān)系只限于極稀溶液。保證熒光分析線性的關(guān)鍵:溶液盡量稀釋(吸光度小于0.05)對(duì)于較濃的溶液，其吸光度超過0.05時(shí)，使熒光物質(zhì)分子之間以及熒光物質(zhì)分子同溶劑分子之間的碰撞增加，導(dǎo)致無輻射去活增加而發(fā)生自熄滅。第16頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月1412108642161412108642ConcentrationFLR

IntensityActualIdeal第17頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光的濃度效應(yīng)熒光隨著濃度增高，強(qiáng)度反而減小，稱為濃度猝滅。原因可能是：a濃度增加，分子碰撞機(jī)會(huì)增加，增加了非輻射損耗。b溶液中其他雜質(zhì)吸收發(fā)出的熒光。（內(nèi)濾光）c吸收譜和發(fā)射譜重疊，熒光又被吸收。（自吸收）d儀器原因第18頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月3儀器結(jié)構(gòu)——紫外分光光度計(jì);―――熒光分光光度計(jì)第19頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光光譜法與紫外－可見分光光度法的比較

儀器結(jié)構(gòu)分析方法熒光光譜法靈敏度高，信息大紫外－可見分光光度法應(yīng)用廣泛第20頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月

三.儀器和試劑

儀器：UV-2450紫外－可見光譜

FluroMax-4分子熒光光譜

試劑：苯、苯酚、苯甲酸、環(huán)己烷、丁酮、異丙叉丙酮、無水乙醇、蒸餾水；

硫酸奎寧(C20H24N2O2)2·H2SO4·2H2O第21頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月四.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）有機(jī)化合物紫外吸收光譜及溶劑效應(yīng)圖譜比色管樣品比色皿參比比色皿圖10.05ml苯/環(huán)己烷10ml10d/環(huán)己烷3ml環(huán)己烷3ml圖20.05g苯酚/環(huán)己烷10ml2d/環(huán)己烷3ml環(huán)己烷3ml圖30.05g苯甲酸/環(huán)己烷10ml

3d/環(huán)己烷3ml環(huán)己烷3ml圖40.05ml丁酮/無水乙醇10ml3ml無水乙醇3ml0.05ml丁酮/蒸餾水10ml3ml蒸餾水3ml圖50.01ml異丙叉丙酮/無水乙醇10ml3d/無水乙醇3ml無水乙醇3ml0.01ml異丙叉丙酮/蒸餾水10ml1d/蒸餾水3ml蒸餾水3ml第22頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）硫酸奎寧激發(fā)、發(fā)射光譜測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析尋找硫酸奎寧的激發(fā)光譜（圖6）和發(fā)射光譜（圖7），找到最大激發(fā)波長(zhǎng)λex和最大發(fā)射波長(zhǎng)λem

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以最大激發(fā)波長(zhǎng)λex為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度。以溶液熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8）。

未知樣測(cè)定：將未知樣與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液同樣條件，測(cè)定熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)濃度。第23頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月五．?dāng)?shù)據(jù)記錄與結(jié)果分析

（一）有機(jī)化合物紫外吸收光譜及溶劑效應(yīng)1.采用Origin軟件繪制圖1－圖5，譜圖上標(biāo)注圖號(hào)。用一張A4紙正反兩面打印5張圖譜，附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。2.在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，討論與圖號(hào)相對(duì)應(yīng)的以下內(nèi)容。圖1－圖3：比較苯環(huán)上不同取代基對(duì)紫外吸收光譜的影響？試說明原因。圖4：比較n

*躍遷隨溶劑極性增大λmax如何改變？試說明原因。圖5：比較

*躍遷隨溶劑極性增大λmax如何改變？試說明原因。第24頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）硫酸奎寧激發(fā)、發(fā)射光譜測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析1.采用Origin軟件繪制圖6、圖7，譜圖上標(biāo)注圖號(hào)。用一張A4紙打印

2張圖譜，附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。2.在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，記錄硫酸奎寧系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知樣品的熒光強(qiáng)度如下：溶液名稱溶液1溶液2溶液3溶液4溶液5溶液6未知溶液溶液濃度μg/mL熒光強(qiáng)度3.在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8），并虛線標(biāo)出未知樣熒光強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的濃度。第25頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023