結(jié)構(gòu)生物學(xué)介紹及進展課件

結(jié)構(gòu)生物學(xué)

，，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的定義顧名思義，結(jié)構(gòu)生物學(xué)就是研究各種生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖類等）的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用的學(xué)科。結(jié)構(gòu)的重要性生物大分子的功能主要取決于其結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的異常會引起功能的改變，也是所謂“構(gòu)像病”的原因。瘋牛病等構(gòu)像病的罪魁禍?zhǔn)住５闹虏〉挠捎诮Y(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了瘋牛病、克雅氏?。ǎ唬┑葌魅拘阅X海綿狀病變（）。分子生物學(xué)：

現(xiàn)代生物學(xué)的主流方向分子生物學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)中最重要的學(xué)科，幾乎每年的諾貝爾化學(xué)獎，生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎都授予這方面的研究。研究各種生物大分子的功能以及在生物體中的生物化學(xué)過程，是分子生物學(xué)最重要的任務(wù)。結(jié)構(gòu)在現(xiàn)代生物學(xué)里的中心地位在分子生物學(xué)中，結(jié)構(gòu)是非常重要的內(nèi)容。只有在獲得相應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)后才能深入地研究其功能和生化過程。舉例酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的結(jié)構(gòu)以及如何與底物的結(jié)合后，才能真正了解這種酶的作用機理；對肌肉中的肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)構(gòu)有了詳細的了解，才能說明肌肉收縮和非肌肉細胞運動的機理。

一共有11項諾貝爾獎授予生物分子結(jié)構(gòu)方面的研究。有結(jié)構(gòu)解析方法研究，也有重要的生物分子結(jié)構(gòu)和功能研究的工作。1962

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A.E.

內(nèi)螺旋外螺旋選擇篩鉀離子通道的三維結(jié)構(gòu)圖2003年諾貝爾化學(xué)獎鉀離子透過細胞膜的輸運行為，對體內(nèi)或是大腦中神經(jīng)信號的傳導(dǎo)至關(guān)重要。然而離子通道的選擇性透過行為卻困擾了生物學(xué)家許多年。鉀離子通道的離子導(dǎo)通機理通過鉀離子通道的三維結(jié)構(gòu)，解釋了它對離子的選擇性透過機理。（1）“多離子透過”的過程：原先通道里有三個鉀離子被束縛在里面，只有體積合適的鉀離子才能通過撞擊，將另一個鉀離子從相反方向彈出，而體積較小的納離子不行。（2）通道內(nèi)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)，模擬了鉀離子在溶液中的水合狀態(tài)。只有水合的鉀離子能夠在通道內(nèi)猶如在水溶液內(nèi)一樣自由地運動。鉀離子通道,()3.2?..

280,69-77(1998)

95,649-655(1998)

289,123-127(2000)

414,37-42(2001)

414,43-48(2001)

415,287-294(2002)111,967-965(2002)423,33–41(2003)結(jié)構(gòu)生物學(xué)進展：

董宇輝，，同步輻射（）小角散射（）自由電子激光（）同步輻射

:.

X射線晶體學(xué)和是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要技術(shù)，2012年10月2日99.2%測定方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)X射線晶體學(xué)747689616綜合方法45851165總數(shù)85058各種生物基因組和功能基因組數(shù)據(jù)基因克隆蛋白制備結(jié)構(gòu)測定結(jié)構(gòu)測定樣品制備蛋白結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的流程靶標(biāo)克隆表達可溶純化結(jié)構(gòu)152721486664081474843802008.6.16獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)核磁共振方法：分辨率與靈敏度不夠，不能確定分子量很大的結(jié)構(gòu)，要求樣品濃度極高，測定效率低下（幾個星期甚至幾個月的數(shù)據(jù)收集時間）。晶體學(xué)方法：對樣品要求過高，高質(zhì)量晶體的獲得困難。實驗耗時單晶難以獲得相位解析需要特殊單晶分辨率低靈敏度低?

蛋白質(zhì)晶體衍射能力很弱：大部分原子為C、N、O、S；晶體質(zhì)量差，晶胞大；相位問題解決困難。理想的光源必須具有以下特點：高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的數(shù)據(jù)；準(zhǔn)直性好：質(zhì)量差、晶胞大的晶體也可以進 行實驗；能量可調(diào)：多波長反常散射解決相位問題。同步輻射正好提供了適合的光源。什么是同步輻射？接近光速運動的電子或正電子在改變運動方向時放出的電磁輻射，因為是在同步加速器上發(fā)現(xiàn)的，所以稱為同步輻射。這種輻射強度高、覆蓋的頻譜范圍廣，可以任意選擇所需要的波長且連續(xù)可調(diào)，因此成為一種科學(xué)研究的新光源。同步輻射裝置示意圖儲存環(huán)部分圖片來自三種發(fā)光元件彎轉(zhuǎn)磁鐵扭擺器(Wiggler)波蕩器(undulator)圖片來自發(fā)光元件光束線實驗站同步輻射的亮度（單位時間，單位面積，單位立體角，一定光子能量范圍內(nèi)的光子數(shù)）和轉(zhuǎn)靶X光機的比較。圖片來自設(shè)計報告2p立體角：180°1毫弧度：0.06°三代光源甚至達到10微弧度實際的蛋白質(zhì)單晶真實單晶體內(nèi)部不是完美的，可以看成有一系列的小晶體鑲嵌而成，每個小晶體可以認為是完美的晶體。這些小晶體取向無序的程度以“鑲嵌度”表征。分子置換法（，）同晶置換法（，，）反常散射法（，，）直接法（）

同步輻射覆蓋了一個很寬的頻譜范圍，從遠紅外到硬X光。而X光機只能提供幾個分立的光子能量。（多對同晶置換）設(shè)法在蛋白質(zhì)晶體中加入一些重金屬離子，同時晶體結(jié)構(gòu)不發(fā)生大的變化（同晶置換），置換前后結(jié)構(gòu)因子的關(guān)系。一個同晶置換可以得到兩個可能的解。兩個同晶置換就可以得到唯一的解。“同步輻射+硒代+樣品冷凍”已經(jīng)成為解析全新結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法。多波長反常衍射（）可以解析全新結(jié)構(gòu)，如果能夠得到足夠的同晶置換晶體的話。如果蛋白質(zhì)里有金屬離子存在，就可以使用方法。硒代。原子散射因子選擇吸收邊附近的幾個波長，相當(dāng)于幾個不同的完全同晶的置換。分子生物學(xué)提供了硒代的手段，對于解析全新結(jié)構(gòu)非常有利。關(guān)鍵是衍射實驗使用的X射線（能量）波長必須可變！同步輻射的作用同步輻射的加入，大大提高了結(jié)構(gòu)測定的速度。()圖片來自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的增加同步輻射促進了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析1980-1990年，獲得解析的蛋白質(zhì)數(shù)量大幅度增加；1980左右，同步輻射開始應(yīng)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中，1990年各種技術(shù)趨于成熟，同步輻射大規(guī)模應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)解析。生物學(xué)家的評論生物大分子結(jié)構(gòu)測定影響了生物學(xué)幾乎所有的領(lǐng)域。幾乎每個星期都有激動人心的結(jié)構(gòu)發(fā)表在如和這樣的雜志上。生物大分子晶體學(xué)已經(jīng)比其他任何學(xué)科更多地得益于同步輻射的應(yīng)用。E.，.實驗的波長選擇f1f2f3f4四個可選擇的波長f1：，f"最大；f2：，f'最大；f3：；f4：。流行做法：一邊收集數(shù)據(jù)，一邊解析結(jié)構(gòu)。一般完成f1數(shù)據(jù)的收集，進行f2數(shù)據(jù)收集時就完成相位解析了。幾個波長？理論上2個波長就足夠破解雙解了，但是有直接法的幫助，1個波長也就足夠了。當(dāng)然波長越多會越好，但是實驗時間的延長往往會帶來不可預(yù)知的因素：輻射損傷，儀器設(shè)備的不穩(wěn)定等。反常衍射的分類單波長反常衍射：；多波長反常衍射：。波長得到的相角三個波長得到的相角烯醇酶-磷酸酶E1

人源“”蛋白與的組合三個波長同步輻射蛋白質(zhì)晶體學(xué)的發(fā)展更小的晶體：生長晶體是蛋白質(zhì)晶體學(xué)的瓶頸，如果能夠解析小晶體的結(jié)構(gòu)將使得許多困難的結(jié)構(gòu)成為可能。更自動化的實驗流程：無論是解析結(jié)構(gòu)還是在藥物研究中的應(yīng)用，大量的嘗試需要自動化的流程。目前，10微米左右的質(zhì)量良好的晶體已經(jīng)能夠解析出生物大分子結(jié)構(gòu)。（，發(fā)表于J...,367,310-318.2007）：可能達到5微米。但是有相當(dāng)多的生物大分子只能夠獲得1微米左右的微晶，如左圖所示的與老年性癡呆相關(guān)的蛋白質(zhì)很難形成大的單晶。目前同步輻射裝置希望能提供1微米的聚焦光斑解析這些m大小晶體的結(jié)構(gòu)。將大大降低生物大分子結(jié)晶的門檻，極大地推動結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和藥物研發(fā)的進展。1m量級蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)解析同步輻射提供了解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最適合的光源。同步輻射的廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及蛋白質(zhì)晶體學(xué)理論、軟件的完善，使得解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成為相對比較常規(guī)的技術(shù)。小角散射

.獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的困難核磁共振方法：分辨率與靈敏度不夠，不能確定分子量很大的結(jié)構(gòu)，要求樣品濃度極高，測定效率低下（幾個星期甚至幾個月的數(shù)據(jù)收集時間）。晶體學(xué)方法：對樣品要求過高，晶體不是想得到就能得到的。實驗耗時單晶難以獲得相位解析需要特殊單晶分辨率低靈敏度低技術(shù)可以研究溶液狀態(tài)的蛋白，但是受到很多限制測定一系列二維、三維核磁共振譜，通過譜峰位置計算原子之間的鍵長、鍵角、二面角等立體化學(xué)參數(shù)，從而得到整個分子的三維結(jié)構(gòu)。存在的限制：靈敏度不夠：需要很濃的溶液分辨率不高：存在分子量上限（<39）采集速度慢：樣品穩(wěn)定性問題缺少弱相互作用和中間體捕獲技術(shù)膜蛋白結(jié)構(gòu)的測定方法不完善蛋白質(zhì)晶體學(xué)的問題主要在于樣品得到晶體探測衍射點強度確定衍射相位得到電子密度分布進而獲得原子位置主要問題：單晶難于制備，特別是復(fù)合物解析相位需要特殊晶體小角散射（）不需要晶體，在溶液中就可進行實驗。不受分子量限制。不受濃度限制。實驗時間短，對樣品穩(wěn)定性要求低。儀器設(shè)備簡單，可以開展原位實驗。圖片來自8.小角散射所需的樣品~50微升溶液；蛋白濃度在0.1-10；分子量在幾千至幾億；單分散（）。圖片來自8.小角散射的優(yōu)點對樣品的要求很低：溶液樣品既可，分子量、濃度不拘，穩(wěn)定性不用很高。有些時候結(jié)晶會引起一些結(jié)構(gòu)上的變化（由于結(jié)晶時候的導(dǎo)致），小角散射實驗在溶液中進行，更好地反映生物大分子的真實狀態(tài)。實驗相對簡單快速，提供了原位研究動態(tài)過程的可能性。小角散射（1D）衍射（3D）1條譜線 上萬個衍射點結(jié)構(gòu)信息（3D）圖片來自8.小角散射的缺點小角散射得到的信息量很少，要得到三維的結(jié)構(gòu)信息是很困難的。只能得到一些比較粗略、低分辨的信息，如生物大分子的大小、形狀等。衍射可以獲得非常多的衍射點強度，能夠解析出三維的結(jié)構(gòu)來。相對于晶體學(xué)衍射，小角散射的理論還不夠成熟。經(jīng)典應(yīng)用生物大分子（散射體）的大小、分布；大致形狀（球形、柱形、橢球形等）。分子越大，實驗越容易：和晶體學(xué)正好相反。最近發(fā)展可以擬合出生物大分子的形狀：利用一系列球諧函數(shù)表征分子外形，這個外形（包絡(luò)）之外密度為零，之內(nèi)是均勻的密度。或者用一系列的虛擬原子（）或者虛擬殘基來描述生物大分子，調(diào)整這些虛擬原子或者虛擬殘基的位置來確定分子形狀。M.B.,V.V.D.I.J...(1997).30,811–815用球諧函數(shù)展開來表示生物大分子形狀。擬合展開系數(shù)，使得計算譜線與實驗最接近。需要正則化方法來進行擬合。程序：D.I.，J...(1992).25,495–503用虛擬原子來表示生物大分子形狀。模擬退火這些虛擬原子的位置，使得計算譜線與實驗最接近。程序：和D.I.，(1999).76,2879–2886重建晶體結(jié)構(gòu)中丟失部分晶體衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的區(qū)域。利用小角散射可以擬合出這些區(qū)域來。程序：,,,，(2002).83,3112–3125生物大分子復(fù)合物已知各亞基分子結(jié)構(gòu)，而復(fù)合物結(jié)構(gòu)未知；改變亞基相對位置及取向來擬合實驗譜線。程序：,，J...(2001).34,527–532研究實例（一）

從基因到功能：脫氨酶206：S.5’();a2+;,.,206159.

DNA.,.

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研究實例（二）：來源于光合細菌的()。結(jié)合后導(dǎo)致構(gòu)型變化，以結(jié)合特定的。這個蛋白屬于()家族，與()()類似。.,J...(2004)341,651–668.圖片來自8.圖片來自8.圖片來自8.在結(jié)合后的變化并不支持晶體學(xué)研究的結(jié)果。：的結(jié)合對大小改變很小。增強了蛋白之間的相互作用，表面電荷分布改變了。圖片來自8.的結(jié)果的仔細分析否認了的機制。以及P(r)的變化遠比機制導(dǎo)致的小。圖片來自8.導(dǎo)致晶體學(xué)結(jié)構(gòu)出問題的原因：

結(jié)晶時產(chǎn)生的通過晶體學(xué)得到的結(jié)構(gòu)計算出來的曲線和實驗明顯不同，說明在結(jié)晶過程中改變了蛋白的結(jié)構(gòu)。晶體學(xué)結(jié)構(gòu)中兩個結(jié)合區(qū)域明顯不對稱（而結(jié)合區(qū)域卻是對稱的），這種結(jié)構(gòu)并不常見。圖片來自8.圖片來自8.研究實例（三）：來源于（巴西固氮螺菌）的(谷氨酸合成酶，)。細菌的()包括兩個亞基：a亞基，162；b亞基，52.3。a亞基結(jié)構(gòu)已知：10。b亞基有個類似物：50–520(1h7w)。（）.,.,.,S.,.,B.&.(2003).J...,278,299332×L-glutamateNADP(+)L-glutamine2-oxoglutarateNADPH+++

谷氨酸合成酶是一種含有中心的黃素蛋白，催化谷酰胺的酰胺基還原轉(zhuǎn)移到2-酮戊二酸（2）的2位上。根據(jù)不同的酶種類，這個過程需要或者，還需要或者，中心是必須的。細菌的需要，真核生物的需要。這個酶和谷酰胺合成酶（）是微生物和植物中氮素同化（）的主要途徑，在動物中的作用還不清楚。細菌包含的（）由a、b兩個部分組成，包含1個，1個和3個不同的。的催化機理示意圖活性的是a和b亞基組成的。小角散射結(jié)果表明a亞基在溶液中是4聚體；b亞基是單體和二聚體混合。兩個亞基組成的在溶液中是4聚體。實驗結(jié)果：1：a亞基；2：；3：b亞基。黑點：實驗數(shù)據(jù)；紅線：模型（外形）；綠色點劃線：a2（曲線1）和a4b（曲線2）晶體學(xué)模型；綠色三角（曲線3）：單體b；綠色圓（曲線3）：二體b；藍線：剛體擬合后的a4（曲線1）和()4；藍色圓（曲線3）：擬合后的b單體與二體混合模型。a4b2a4重疊在上外形a4b2a4()4最終確定的結(jié)構(gòu)：4聚的a亞基外圍包圍著4個b亞基。小角散射提供了研究生物大分子溶液狀態(tài)的一種方便手段。實驗數(shù)據(jù)能夠提供的信息量不多，但是在有部分晶體結(jié)構(gòu)的情況下，小角散射能夠發(fā)揮相當(dāng)重要的作用。小角散射研究生物大分子溶液結(jié)構(gòu)仍是一種正在發(fā)展的技術(shù)，有很大的提升余地。自由電子激光

發(fā)展才是硬道理。鄧小平各種生物基因組和功能基因組數(shù)據(jù)基因克隆蛋白制備結(jié)構(gòu)測定結(jié)構(gòu)測定樣品制備蛋白結(jié)構(gòu)晶體，晶體，晶體！靶標(biāo)克隆表達可溶純化結(jié)構(gòu)152721486664081474843802008.6.16解決的方法：分子不排隊，讓光子排隊探測器分子相干光源利用一束相干性很好、強度很高的X光來照射分子，記錄下相干散射的強度，也能得到分子中原子的結(jié)構(gòu)。晶體的衍射：雖然每一個光子到達晶體的時間（位相，）是無規(guī)的，但是晶體內(nèi)原子空間排列的有序性限定了出射光子只能沿著有限的方向，因此出射的X射線強度還是很高的，可以很容易就探測得到。分子的散射：在原子空間排列無序的條件下，出射光子的方向不受限制，因此出射的X射線強度變得非常微弱。入射X射線的光子如果沒有確定的位相關(guān)系（相干），那么即使目前最強的光源，這些無序到達的光子產(chǎn)生的信號還是弱得無法探測。（強度相加，N個光子N倍信號）除非入射X射線的光子“排著整齊的隊伍”，具有確定的位相關(guān)系（相干），散射的光子產(chǎn)生的信號就有確定的相位關(guān)系，能夠進行振幅疊加，N個光子產(chǎn)生N2倍信號（類似共振）。關(guān)鍵：光源目前的光源（包括第三代同步輻射）還不能提供足夠的強度和相干性；能夠滿足條件的光源是：X射線自由電子激光（）。理由：原子分辨率需要X光；強度和相干性需要激光。什么是自由電子激光？讓產(chǎn)生同步輻射的電子同時發(fā)光（光子相位相同），這樣就得到激光。這個過程和常規(guī)的激光（可見光、紅外、紫外激光）是類似的。溶菌酶30

可能的問題分子損傷：極高的強度會使分子完全離解，但是可以在分子離解之前就得到足夠的信號，計算機模擬證實了這一點。相位問題：過采樣技術(shù)（）可以解決這個問題。探測技術(shù)：需要發(fā)展。實驗技術(shù)：如何獲得單分子的散射信號，需要研究。作用下溶菌酶分子的離解2的脈沖可以得到可靠的結(jié)構(gòu)，5以上會有誤差，10以上基本不可用。實驗技術(shù)的問題強度很高的，怎么固定樣品？既然能夠把樣品在瞬間揮發(fā)，也會在瞬間揮發(fā)固定樣品的樣品架！實驗技術(shù)（1）：

實驗技術(shù)（2）：

把蛋白質(zhì)固定在非晶態(tài)的冰里面。類似冷凍電鏡技術(shù)。使用一束脈沖足夠短的激光，就可以得到可信的散射信號。但是散射信號如何變成結(jié)構(gòu)（電子密度）？相位還是探測不到。晶體衍射相位問題的根源：傅立葉取樣定律和衍射的中心對稱性結(jié)構(gòu)解析就是求出晶胞內(nèi)電子密度分布：需要得出N個點的密度r(,1,…)，必須知道N個振幅F(1,…)和相位j(1,…)。由于r必須為實數(shù)，F(xiàn)()()，j()()。因此只有2個獨立的衍射峰強度可以測量。晶體限制了可能獲得衍射的位置：必須滿足定律。有N個未知數(shù)，但是只有2個實驗值（或者方程）。采集多套數(shù)據(jù)就是增加了實驗值（或者方程）的數(shù)目。如果樣品不是晶體，那么可以在任何地方探測到散射信號：。傅立葉取樣定律如是說：實空間長度L，分成N份；倒易空間長度P，也分成N份；倒易空間長度仍為P，分成2N份；那么實空間長度為2L，也分成2N份。但是實空間