基因診斷與基因治療-課件

疾病的基因診斷技術(shù)1ppt課件一、基因診斷

（一）、基因診斷的對象1、病原生物的侵入常用方法：顯微鏡及免疫學(xué)方法?；蛟\斷的優(yōu)勢：高敏感性。高特異性。在無法得到商業(yè)化抗體時，基因診斷就成為唯一手段。目前，基因診斷已在病毒性肝炎，受滋病等傳染病的診斷中發(fā)揮了不可代替的作用。2ppt課件2、先天遺傳性疾患基因突變所致遺傳病。診斷方法常規(guī)方法：分析臨床癥狀及生化檢查?；蛟\斷：檢測突變基因，確定發(fā)病原因。病因不明的疾?。喝绺哐獕?、自身免疫性疾病等，可能是某些基因的改變造成。因此基因診斷不僅對臨床診斷，而且對疾病的病因和發(fā)病機理的研究都具有重要的意義。3ppt課件3、后天基因突變引起的疾病最典型的例子就是腫瘤。腫瘤的發(fā)病機理尚未完全明了，但人們可以初步認為腫瘤的發(fā)生是由于個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖。無論是抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變，如果確定這些改變的發(fā)生，都必須進行基因診斷。4ppt課件4、其它方面：如個體識別，親子關(guān)系識別，法醫(yī)物證等。5ppt課件（二）、基因診斷的方法

可致疾病的遺傳背景改變主要有兩類：1、遺傳物質(zhì)即DNA或RNA的水平的變化。例如病毒感染后其基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無到有，癌基因表達水平的從低到高。2、遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化即基因突變，如點突變引起的基因失活，及染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。6ppt課件基因診斷的方法：從理論上說所有檢測基因水平或結(jié)構(gòu)的方法都應(yīng)可用于基因診斷。但如考慮其臨床適用性，靈敏度等問題，下列兩種方法可看作是有應(yīng)用前景的基因診斷的方法：1、核酸雜交2、聚合酶鏈反應(yīng)7ppt課件1、核酸雜交

核酸雜交：原理是核酸變性和復(fù)性理論，即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為：DNA印跡雜交(Southernblothybridization)RNA印跡雜交(Northernblothybridization)。8ppt課件核酸雜交的步驟：（1）制備樣品：則可直接在變性條件下電泳分離，從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長度的片段凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進行分離，凝膠上形成特定的區(qū)帶。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。RNA樣品然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。9ppt課件玻璃板干燥濾紙硝酸纖維素膜酶切電泳電泳后凝膠電泳緩沖液顯色緩沖液浸濕的濾紙紫外交聯(lián)雜交10ppt課件（2）制備探針

探針是指一段能和待檢測核酸分子按照堿基配對原則而結(jié)合的核酸片段。它可以是一段DNA或RNA。

探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。通過檢測膜上的核酸分子結(jié)合上的探針分子，就可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，及其在電泳凝膠上的位置，就知道了它的分子大小。標記物：放射性標記物：32P、3H、35S非放射性標記物：生物素、地高辛(dig)

11ppt課件（3）雜交首先要進行預(yù)雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。變性標記好的探針讓探針與膜在特定的溫度下反應(yīng)洗去未結(jié)合的探針分子。12ppt課件（4）檢測

檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)的方法進行檢測。

13ppt課件地高辛(dig)標記探針的檢測。BCIP/NBT紫藍色沉淀抗地高辛抗體堿性磷酸酶地高辛連接臂待檢測DNA探針14ppt課件2、聚合酶鏈反應(yīng)：

（polymerasechainreaction,PCR）在同一試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進行同一段DNA片段的合成。DNA可直接用于PCR反應(yīng)。RNA要反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再進行PCR反應(yīng)。15ppt課件PCR的基本原理TwoprimersABFreenucleotidesTaq

DNApolymeraseMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+BuffercontainingmagnesiumTargetDNA5’3’3’5’16ppt課件Thebasicprotocol--denaturationTargetDNA95oC5’3’3’5’5’3’3’5’17ppt課件Thebasicprotocol--annealing~55oC5’5’ABprimersAB5’3’3’5’18ppt課件Thebasicprotocol--extension72oC5’5’Taqpolymerase3’5’5’3’19ppt課件Thebasicprotocol--extension72oC5’5’5’3’3’5’3’3’Attheendofthefirstcycle20ppt課件5’5’5’3’3’5’3’3’95oC5’5’3’3’5’3’denaturation5’3’21ppt課件5’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’55oCannealing22ppt課件5’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oCextension23ppt課件5’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oCextensionAttheendofthesecondcycle24ppt課件5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’95oCdenaturation25ppt課件5’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’55oCannealing26ppt課件5’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’72oCextension27ppt課件5’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’5’3’372oCextensionTargetDNATargetDNAAttheendofthethirdcycle28ppt課件OnePCROnebillioninabout2hours!Attheendofeachcycle,theamountofaimDNAfragmentdoubledBytheendof30cycles,about1billionoftheaimDNAmoleculeswereproducedfromtheoriginaloneaimDNAmolecule230=1,073,741,82429ppt課件PCR技術(shù)及其在臨床診斷應(yīng)用中的進展實時熒光定量PCR的原理30ppt課件實時熒光定量PCR的特點

特異性：FQ-PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高

敏感性：

FQ-PCR的敏感度通常達102拷貝/ml，

重復(fù)性：

FQ-FCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，同一標本的CT值相同，但其產(chǎn)物的熒光量卻相差甚大。

降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險性。

31ppt課件PCR-ELISA技術(shù)

PCR引物5′端標記上地高辛或生物素等非放射性標記物，擴增產(chǎn)物滴加到固定有特異性探針的微孔板上，再加入抗地搞辛或生物素酶標抗體一辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終加底物顯色，在酶標板上測定OD值判定結(jié)果。

32ppt課件PCR-ELISA法的特點

1.特異性

近似于FQ-PCR，兩者均具有引物和探針的雙重特異性。

2.敏感度

較FQ-PCR略高

3.可加入內(nèi)標，監(jiān)測樣品PCR受抑制情況，監(jiān)測PCR平均效率，修正實驗數(shù)據(jù)。

4.PCR-FLISL法產(chǎn)物污染的風(fēng)險性相對較大。

33ppt課件PCR－ELISA的步驟：核酸提取和制備進行PCR擴增微孔預(yù)雜交產(chǎn)物雜交顯色檢測分析

34ppt課件35ppt課件PCR－ELISA的不足及消減措施：

1.污染問題嚴重。PCR－ELISA的PCR擴增能力極強，污染易產(chǎn)生假陽性。另外ELISA是一個開放性的反應(yīng)，特別是洗板，也容易污染引起假陽性。

2.顯色定量分析相對于最近的探針熒光分析，無論是靈敏度還是特異性上都有差距。

3.操作繁瑣，這也是嚴重制約臨床應(yīng)用的重要因素。注意：PCR－ELISA一定要嚴格分區(qū)，及時進行空間和儀器消毒，嚴防污染。36ppt課件（三）腫瘤的基因診斷1、與腫瘤相關(guān)的基因：（1）K-ras基因：位于染色體12p12.1上的編碼21kD（p21）蛋白的編碼基因。K-ras點突變成變異型p21與癌變有關(guān)。點突變集中在第12，13，61等氨基酸的密碼子上，對K-ras基因點突檢測不僅對腫瘤的診斷具有一定的價值。

37ppt課件（2）p53基因：是一種抑癌基因，是目前人類腫瘤中最常發(fā)生變化的基因。它位于染色體17p13.1上，編碼53KD的核磷酸蛋白，此蛋白通過p21蛋白參與細胞周期的調(diào)控，對細胞的分裂和增殖起負調(diào)節(jié)作用。若突變，則最終使細胞生長和分化的調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細胞的持續(xù)分裂和癌變。在許多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有p53基因的異常，提示p53基因的異?？赡芘c腺瘤的癌變有關(guān)。38ppt課件（3）DCC基因

位于染色體18q21.3上的抑癌基因。腫瘤組織，DCC基因的雜合性丟失和DCCmRNA表達低下在胃癌，大腸癌中呈現(xiàn)較高的頻率。39ppt課件（4）微衛(wèi)星微衛(wèi)星，即短串聯(lián)重復(fù)(Short

Tandem

Repeat，STR)，它是由2-6bp重復(fù)單位構(gòu)成的DNA序列。通常多態(tài)性片段長度在100-300bp。以人類基因組中平均每15-20kb就存在1個STR座位。微衛(wèi)星DNA具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，所以非常適合作為遺傳學(xué)DNA分子標記，目前STR分析已廣泛應(yīng)用于遺傳制圖、連鎖性分析、親子鑒定、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究等諸多領(lǐng)域。據(jù)報道，在家族性大腸癌有高比率的微衛(wèi)星反復(fù)排列數(shù)量的異常。

40ppt課件（5）端粒酶染色體末端的端粒在人體中是由T、T、A、G、G、G6個堿基構(gòu)成一個單位，在生殖細胞中以長約20kb，體細胞中以6-10kb的長度進行反復(fù)排列，通常認為端粒與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)，其長度隨著細胞的反復(fù)分裂而縮短，縮短到一定程度細胞再分裂，也就是說，細胞分裂的壽命取決于端粒的長度。在癌細胞中存在有延長端粒的酶。胃癌、大腸癌、腎癌、前列腺癌等端粒酶表現(xiàn)為高度的活性。除了表達異常外，端粒的微小缺失和易位也與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。

41ppt課件（6）p16基因

p16基因定位于9p21