病毒檢驗(yàn)技術(shù)-病毒的其他鑒定技術(shù)（微生物檢驗(yàn)課件）

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病毒鑒定的方法

1、病毒增殖后導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化:①細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)：細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細(xì)胞溶解出現(xiàn)空斑。2②多核巨細(xì)胞和包涵體。

細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，胞漿內(nèi)或核出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；

2.紅細(xì)胞吸附：血凝現(xiàn)象。

3.細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化。34.病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定

(1)空斑或蝕斑形成試驗(yàn)

空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周?chē)换罴?xì)胞包圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒感染所引起的。4蝕斑（plaque）測(cè)定蝕斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）病毒的數(shù)量與病毒毒力測(cè)定。(2)50%感染量或50%組織感染量（ID50或TCID50）測(cè)定

：用來(lái)估計(jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度。54.其他實(shí)驗(yàn)

(1)干擾現(xiàn)象:

某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象，如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。6(2)耐酸試驗(yàn)

腸道病毒對(duì)酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。

(3)乙醚敏感試驗(yàn)病毒外圍如有類(lèi)脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄?lèi)脂包膜的依據(jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。7

一、血清學(xué)診斷方法

（一）抗原的檢測(cè)：

病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。病毒血清學(xué)診斷及其他快速診斷方法81．免疫熒光技術(shù)適合于型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒等。肝活檢組織中的肝炎病毒、神經(jīng)組織中的單純皰疹病毒、腦組織中的狂犬病毒或其他脫落細(xì)胞和活檢組織中的病毒抗原檢測(cè)。92．酶免疫技術(shù)

有酶免疫組化和酶免疫吸附(ELlSA)試驗(yàn)法。測(cè)定標(biāo)本中游離的抗原或抗體。如檢測(cè)乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗體等。103.其他技術(shù)

如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。11●標(biāo)本采集時(shí)間、急性期單份血清IgM、雙份血清IgG●常用血清試驗(yàn)原理和用途

1、中和試驗(yàn)

（二）抗體檢測(cè)

2、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)3、血凝及血凝抑制試驗(yàn)4、免疫熒光試驗(yàn)5、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)6、免疫印跡實(shí)驗(yàn)7、固相免疫放射測(cè)定12早期抗體檢測(cè)

檢測(cè)病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體，如測(cè)定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天性感染，測(cè)定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HAV等。13

二、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法

只要有完整的特異基因片段存在，就可進(jìn)行診斷。14（一）核酸分子雜交技術(shù)：1．斑點(diǎn)雜交法

將待測(cè)的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上，變性后，用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。用32p或131I同位素標(biāo)記的探針通過(guò)放射自顯影，可直接觀察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質(zhì)標(biāo)記，然后采用酶反應(yīng)或酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，已被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。152.原位分子雜交技術(shù)

在細(xì)胞原位暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記特異核酸探針進(jìn)行雜交。通過(guò)顯色技術(shù)可顯示特定雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。16

3.Southern印跡和Northern印跡法

Southern印跡法用于DNA的雜交。提取DNA,用內(nèi)切酶切割后，進(jìn)行瓊脂糖電泳按分子量使DNA分開(kāi)，將DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交?？梢詸z測(cè)病毒DNA特異序列。

Northern印跡法用于RNA雜交分析。將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。用于檢測(cè)RNA或mRNA。17

（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增可診斷病毒性感染。(1)DNA病毒：可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增其特異片段。(2)RNA病毒：可通過(guò)RT-PCR技術(shù)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。18(3)定量PCR技術(shù)：對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行原始標(biāo)本定量，對(duì)病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時(shí)，對(duì)研究病毒和機(jī)體之間的關(guān)系提供了參考。19（三）基因芯片技術(shù)將數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)