免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-免疫原和抗血清的制備

知識(shí)目標(biāo)1.掌握：免疫原和佐劑的概念（重點(diǎn)）。2.熟悉：抗血清制備時(shí)免疫動(dòng)物的選擇和免疫方案的制定

?？寡逯苽涞牧鞒蹋y點(diǎn)）。3.了解：蛋白質(zhì)的分離和純化方法

；佐劑的應(yīng)用。能力目標(biāo)1.熟練掌握免疫原的制備方法。2.學(xué)會(huì)抗血清的制備方法。素質(zhì)目標(biāo)細(xì)心、耐心、免疫學(xué)基本思維教學(xué)目標(biāo)免疫原和佐劑的概念。抗血清制備時(shí)免疫動(dòng)物的選擇和免疫方案的制定

?？寡逯苽涞牧鞒?。蛋白質(zhì)的分離和純化方法

。佐劑的應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄免疫原的制備一免疫血清的制備二抗原和抗體是免疫學(xué)檢測(cè)中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測(cè)。前言第一節(jié)免疫原的制備

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與之發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。眾多的抗原物質(zhì)中絕少是單一組分的，所以必須從復(fù)雜的物質(zhì)中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。一、細(xì)胞性免疫原的制備1.綿羊紅細(xì)胞抗原制備采集新鮮綿羊紅細(xì)胞注入無(wú)菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分搖動(dòng)15分鐘后除去纖維蛋白，再以無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細(xì)胞懸液，即可應(yīng)用。

2.細(xì)菌抗原的制備細(xì)菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動(dòng)力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時(shí)后應(yīng)用。

蛋白質(zhì)、酶、核酸、細(xì)菌毒素等皆為可溶性抗原，這些物質(zhì)大多來(lái)源于人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞，要想獲得此類抗原，通常要先破碎組織和細(xì)胞，再進(jìn)一步提取和純化。

二、可溶性抗原的制備及鑒定1.組織勻漿的制備

高速搗碎法研磨法（一）組織和細(xì)胞中可溶性抗原的粗提

2.細(xì)胞破碎的方法⑴反復(fù)凍融法⑵超聲破碎法⑶溶菌酶處理法⑷自溶法⑸表面活性劑處理法1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠過(guò)濾和離子交換層析4.親和層析5.電泳

（二）可溶性抗原的提純

1、超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來(lái)。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。常用：鹽析沉淀法用硫酸銨等中性鹽中和蛋白質(zhì)表面的電荷及破壞水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀。3、凝膠過(guò)濾法凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)4、離子交換層析法原理：帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠可吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)因等電點(diǎn)不同所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。梯度洗脫時(shí)逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個(gè)部分而被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。5、親和層析法優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。

純化抗原的鑒定內(nèi)容包括含量、分子量、純度和免疫活性的鑒定等。鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫電泳法、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。

（三）純化抗原的鑒定

用化學(xué)合成法或基因重組法制備的抗原，稱之為人工抗原，包括人工結(jié)合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。三、人工免疫原制備

半抗原不能直接做為免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性。這種經(jīng)過(guò)人工修飾的半抗原稱之為人工合成抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。

（一）人工合成抗原制備

1.常用的載體⑴蛋白質(zhì)類⑵多肽聚合物⑶大分子聚合物

2.半抗原與載體的連接半抗原+載體（蛋白、合成載體）=完全抗原物理法或化學(xué)法連接3.人工結(jié)合免疫原的鑒定要鑒定人工結(jié)合免疫原的質(zhì)量，必須要測(cè)定偶聯(lián)在載體上的半抗原量，常用的測(cè)定方法有吸收光譜分析法和核素標(biāo)記半抗原滲入法。

用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當(dāng)載體DNA分子相結(jié)合，然后引入受體細(xì)胞中（如大腸桿菌或酵母菌）使之表達(dá)，能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、佐劑為了促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，可在注射抗原的同時(shí)，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為免疫佐劑（immunoadjuvant）,簡(jiǎn)稱佐劑（adjuvant）。

在進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)最常用的佐劑是福氏（Freund）佐劑，根據(jù)有無(wú)卡介苗又可分為福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑。福氏不完全佐劑是由油劑和乳化劑制成，在福氏不完全佐劑中加入卡介苗就成了福氏完全佐劑。

（一）佐劑的種類

福氏佐劑和抗原的比例為1:1。由于福氏佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

混合方法：研磨法攪拌注射器混合法注射器混合法1.改變抗原的物理性狀，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，從而有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其抗原提呈能力；3.可加強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)其對(duì)抗原的處理能力。

（二）佐劑的作用機(jī)制第二節(jié)免疫血清的制備將抗原以不同途徑免疫動(dòng)物，可從動(dòng)物血清中分離得到抗體，因而把這類含有抗體的血清稱為抗血清或免疫血清。天然抗原常含有多種抗原決定簇，可刺激動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆針對(duì)該抗原的多種抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，所以抗血清實(shí)質(zhì)上是多克隆抗體（PcAb）。多價(jià)抗原多個(gè)B細(xì)胞克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）多克隆抗體抗血清的制備流程免疫動(dòng)物選擇免疫方案制定動(dòng)物采血抗血清分離純化及鑒定

抗血清的保存

一、免疫動(dòng)物選擇1．抗原來(lái)源與免疫動(dòng)物的種屬關(guān)系2．動(dòng)物的個(gè)體情況

3．抗原的性質(zhì)

4．抗血清的用量及要求

二、免疫方案制定

1．免疫原的劑量2．免疫途徑

3．免疫時(shí)間間隔

次序日序（天）注射途徑注射劑量（ml）抗原11多點(diǎn)皮內(nèi)1.0沙門菌O抗原26靜脈0.5沙門菌O抗原311靜脈0.5沙門菌O抗原416靜脈1.0沙門菌O抗原519靜脈2.0沙門菌O抗原傷寒沙門菌O抗原免疫家兔的方案三、動(dòng)物采血1．頸動(dòng)脈放血法：最常用的方法2．心臟采血法：此法多用于豚鼠等小動(dòng)物，技術(shù)要求高

3．靜脈采血法：可多次進(jìn)行，所以可收集到的血液量較多

四、抗血清的分離純化及鑒定采集的血液多采用在室溫自然凝固，待凝塊收縮后分離血清。前者迅速，但獲得血清較少；后者時(shí)間長(zhǎng)，但獲得血清多，而且效價(jià)穩(wěn)定。（一）抗血清的分離1.特異性抗體的純化

①親和層析法②吸附劑方法2.IgG類抗體的純化

①鹽析②凝膠過(guò)濾③離子交換和親和層析法（二）抗血清的純化1.抗體效價(jià)的鑒定

一般原則是顆粒性抗原用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

2.抗體特異性的鑒定

常用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行鑒定。

（三）抗血清的鑒定3.抗體純度的鑒定

可采用免疫電泳、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、SDS等方法鑒定。4.抗體親和力的鑒定

常用ELIS