酶免疫技術(shù)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）一、基本原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開(kāi)。加入酶的底物后，通過(guò)酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度，對(duì)標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量分析。二、ELISA的方法類(lèi)型（六種）（一）雙抗體夾心法檢測(cè)抗原

將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.原理E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測(cè)抗原（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點(diǎn)（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無(wú)抗原）3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原

雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果待檢標(biāo)本中含有RF，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。使用抗體的F(ab’)2或Fab片段作為酶標(biāo)抗體可消除RF的干擾。3．注意事項(xiàng)（二）雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測(cè)定。1．原理EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測(cè)抗原3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無(wú)抗原）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測(cè)抗原

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過(guò)高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。2．注意事項(xiàng)（三）間接法檢測(cè)抗體

將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1．原理

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測(cè)抗體（1）將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加稀釋的受檢血清，洗滌。（3）加酶標(biāo)二抗，洗滌。（4）加底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中待檢抗體的量。

2．技術(shù)要點(diǎn)4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無(wú)抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測(cè)抗體

由于此法易受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行一定稀釋后才能測(cè)定。3．注意事項(xiàng)（四）競(jìng)爭(zhēng)法

酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。

1．競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原原理酶標(biāo)抗原EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測(cè)管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對(duì)照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對(duì)照管中顏色深，待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。技術(shù)要點(diǎn)3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無(wú)抗原）和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

抗體的測(cè)定一般不使用競(jìng)爭(zhēng)法。當(dāng)抗原雜質(zhì)難以去除，不易得到足夠的純化抗原或抗原的性質(zhì)不穩(wěn)定時(shí)，可采用這種方法測(cè)定抗體。如HBcAb和HBeAb的檢測(cè)，由于e抗原較核心抗原僅多29個(gè)氨基酸，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖虼薍BcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法，但模式有所不同。2．競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體（1）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測(cè)定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。技術(shù)要點(diǎn)固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb3.加酶作用的底物顯色3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（+）YYYEYYYE2.加待檢物（無(wú)抗體）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（-）YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb（2）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測(cè)定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無(wú)抗體）和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb（五）捕獲法檢測(cè)IgM抗體

將抗人IgM抗體吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中的IgM類(lèi)抗體多被固相抗體捕獲。加入特異抗原與固相抗體捕獲的IgM類(lèi)抗體結(jié)合，再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。最后根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢IgM抗體的含量。1．原理（1）將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加人待檢標(biāo)本，溫育，洗滌。（3）加入特異性抗原，溫育，洗滌。（4）加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，溫育，洗滌。（5）加入底物，溫育一定時(shí)間，顯色，用酶標(biāo)比色儀測(cè)定結(jié)果。2．技術(shù)要點(diǎn)固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE固相捕獲法檢測(cè)lgM抗體5.加酶作用的底物不顯色5.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體（IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYYEYYYYYYEYY2.加待檢物（無(wú)特異性IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYY（+）（-）洗滌洗滌捕獲法

采用固相捕獲法檢測(cè)IgM類(lèi)抗體時(shí)要注意的是RF（IgM類(lèi)）及其它非特異IgM的干擾。RF（IgM類(lèi)）能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動(dòng)物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。

3．注意事項(xiàng)

非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，所以會(huì)影響測(cè)定的靈敏度。因此，使用本法測(cè)IgM，必須對(duì)臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。（六）雙抗原夾心法檢測(cè)抗體

將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。1．原理2．技術(shù)要點(diǎn)E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測(cè)抗體4.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物（無(wú)抗體）洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測(cè)抗體ELISA的技術(shù)要點(diǎn)包括三個(gè)方面：反應(yīng)所需各種試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)酶標(biāo)記的抗原和抗體固相的抗原或抗體標(biāo)記酶作用的底物（一）試劑的制備1.抗原和抗體天然抗原和人工抗原多克隆抗體和單克隆抗體2.酶標(biāo)結(jié)合物的制備：戊二醛交聯(lián)法或改良過(guò)碘酸鈉法3.包被與封閉包被：Ph9.6的碳酸鹽緩沖液，4-8℃過(guò)夜或37℃2小時(shí)封閉：1%-5%牛血清白蛋白或10%小牛血清（二）最適工作濃度的選擇（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度（A）值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇

在ELISA測(cè)定中應(yīng)對(duì)包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇以達(dá)到最佳的測(cè)定條件以間接法測(cè)抗體為例（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。（2）將強(qiáng)陽(yáng)性參考血清、弱陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋?zhuān)訕?，溫育，洗滌。?）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，溫育，洗滌。2．棋盤(pán)滴定法選擇包被抗原工作濃度

（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。（5）選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清的A值為0.8左右，陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為工作濃度。參考血清各抗原稀釋度的吸光度值（A）1:501:1001:2001:4001:800強(qiáng)陽(yáng)性1.201.040.840.680.42弱陽(yáng)性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04間接ELISA法包被抗原最適工作濃度的選擇1．加樣

應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。2．溫育

注意反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致，以防止“邊緣效應(yīng)”。3．洗滌

手工洗板是在每次溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后用緩沖液洗滌2或3次，拍干。使用洗板機(jī)洗滌次數(shù)要適當(dāng)增加。（三）測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)化4．顯色根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。5．比色要注意波長(zhǎng)的選擇。操作中應(yīng)注意避免出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用

應(yīng)用1．病原體及其抗體測(cè)定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2．激素測(cè)定

如T3、