豬心細胞色素C的制備與測定

豬心細胞色素C的制備與測定及分子量的測定摘要：從豬心中通過溶解、沉淀、透析等方法將細胞色素C提取出來，再采用消光法鑒定及測定細胞色素C,測定細胞色素C的產(chǎn)量、純度及產(chǎn)率。然后，測定細胞色素C溶液的光吸收值，并繪制吸收曲線。最后，采用SDS電泳法來測定豬心細胞色素C的分子質(zhì)量，繪制標(biāo)準曲線圖，在圖中查出細胞色素C的分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞：豬心，細胞色素C,透析，消光，SDS電泳前言：細胞色素C(cytochromec)是細胞色素一種，又稱細胞色素丙。由牛、馬、豬心或酵母分離而得，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。分子量13000。等電點pH值10以上。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B和細胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。在酶存在的情況下，對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。通常外源性細胞色素C不能進入健康細胞，但在缺氧時，細胞膜的通透性增加，細胞色素 C便有可能進入細胞及線粒體內(nèi)，增強細胞氧化，提高氧的利用。通過細胞色素C可以判定生物關(guān)系的遠近，親緣關(guān)系越近的生物，其細胞色素 C越相似或相同。向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起進行勻漿，大部分的蛋白質(zhì)都沉淀下來，細胞色素則存留在三氯乙酸溶液中。將硫酸銨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸銨與抽提液中的肌紅蛋白、血紅蛋白等一起沉淀下來，細胞色素C仍存留于溶液中。進一步用三氯乙酸酸化此溶液，細胞色素C就沉淀下來，然后透析。在550毫微米波長下，細胞色素的克分子消光值為：氧化型細胞色素C：K1=0.9X10分子/克分子/厘米；還原型細胞色素C：K2=2.77X10/克分子/厘米。通過透析用消光法鑒定及測定。用SDS電泳測定細胞色素分子質(zhì)量。SDS是一種陰離子去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵。它與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于均一的溶液中。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子質(zhì)量在15KD到200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此被應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定。材料1.1試劑1.1.1豬心細胞色素C制備與測定試劑豬心10%氫氧化鈉溶液(100克/升)硫酸銨粉末20%三氯乙酸溶液(200克/升)0.145mol/L三氯乙酸溶液飽和硫酸銨溶液10mmol/L鐵氰化鉀溶液飽和連二亞酸鈉溶液1.1.2豬細胞色素C分子量的測定試劑A液：30%(w/v)丙烯酰胺、0.8%(w/v)雙丙烯酰胺B液：75ml2mol/LTris-Hcl(pH8.8)、4ml10%SDS、21ml蒸餾水C液：50ml1mol/LTris-Hcl(Ph6.8)、4ml10%SDS、46ml蒸餾水電泳緩沖液：3gTris、14.4g甘氨酸、1gSDS加蒸餾水至1L，pH8.3左右5x樣品緩沖液：0.6ml1mol/LTris-Hcl(Ph6.8)、5ml50%甘油、2ml10%SDS、0.5ml2-巰基乙醇、1ml1%漠酚藍、0.9ml蒸餾水染色液：0.5g考馬斯亮藍R-250脫色液：200ml乙醇、50ml乙酸，定容500mlTEMED過硫酸銨1.2儀器1.2.1豬心細胞色素C制備與測定儀器大燒杯、玻璃棒組織搗碎機細布大玻璃漏斗大布氏漏斗透析袋PH試紙2100型紫外可見分光光度計磁力攪拌器1.2.2豬細胞色素C分子量的測定儀器微型凝膠電泳裝置電源（電壓300V,電流500A）100°C沸水浴Eppendorf管微量注射器脫色搖床操作2.1豬心細胞色素C制備與測定的操作步驟2.1.1豬心細胞色素C的制備取豬心若干，剔除脂肪，稱量，絞碎。加入0.145mol/L的三氯乙酸溶液（加入量按1000g/L心肌組織計算），攪勻抽提。將此混和抽提物于室溫下放置3小時，然后用細布過濾。用10%氫氧化鈉溶液將上述混合液調(diào)到PH7.3，測量并記錄此抽提液的體積，再于攪拌下慢慢地加入硫酸銨粉末（加入量按500克/混合液計算）。用布氏漏斗抽濾，出去沉淀。經(jīng)常更換濾紙，收集粉紅色濾液。測量并記錄此濾液的體積，攪拌下再加入硫酸銨粉末，（加入量按50克/升濾液計算）。此鹽析液于冰箱中放置過夜。上述鹽析液經(jīng)放置后出現(xiàn)少量沉淀，用布氏漏斗抽濾（雙層濾紙），出去沉淀，保留上清液，向上清液中加入20%三氯乙酸溶液（加入量按25毫升/升上清液計算），以沉淀細胞色素C。迅速地于3500轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集細胞色素C沉淀，再將這個磚紅色的沉淀懸浮于飽和硫酸銨溶液中（飽和硫酸銨的體積按150毫升/公升心肌組織計算，可根據(jù)實驗操作情況減少30-50%）。將此懸浮液移于透析袋中，對水透析4-5小時，離心（3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘）除去少量暗黃色沉淀，紅色的細胞色素C溶液則應(yīng)貯于零下15C。記錄此溶液體積。2.1.2測定細胞色素C的產(chǎn)量、純度及產(chǎn)率氧化型樣品的消光值E」按下表加入試劑及樣品，于550毫米,波長下測出氧化型樣品消光值^試^^^—目樣品（毫升）空白（毫升）0.1mol/LPH7.4磷酸鈉緩沖液3.85.8適當(dāng)稀釋的細胞色素C溶液2.00鐵氰化鉀溶液（0.01mol/L）0.20.2還原型樣品的消光值E2：按下表加入試劑及樣品，于550毫微米波長下測出還原型樣消光值。試劑一 —MM_樣品（毫升）空白（毫升）0.1mol/LPH7.4磷酸鈉緩沖液3.85.8適當(dāng)稀釋的細胞色素C溶液2.00飽和的連二亞硫酸鈉溶液0.20.22.1.3測定產(chǎn)品的分光光度吸收值將上述操作中的氧化型及還原型溶液取來測定可見光不同波長下的吸收值，繪出吸收曲線（波長一光密度值）。2.2豬心細胞色素C分子量測定操作步驟2.2.1灌制分離膠將玻板洗凈，夾好，然后配制分離膠，加入試劑如下：兩塊14%的分離膠，需12mlTOC\o"1-5"\h\zA液 5.6mlB液 3.0ml蒸餾水3.4ml10%過硫酸銨 0.1mlTEMED0.01ml混合后，加入制膠室中，緩慢加蒸餾水壓平，聚合。2.2.2灌制堆積膠A液 0.67mlB液 1.0ml蒸餾水2.3ml10%過硫酸銨 0.03mlTEMED0.005ml加入制膠室中，加上梳子，聚合后拔出梳子，加好電泳緩沖液，加樣。2.2.3電泳調(diào)電壓150，電泳80分鐘左右，指示劑到底部即完成。2.2.4染色剝膠后用染色液染色15分鐘，再用脫色液2小時即可看見條帶。2.2.5拍照、量距離，測定分子量數(shù)據(jù)記錄與處理3.1測定細胞色素C的產(chǎn)量、純度及產(chǎn)率E「0.070，E「0.098A280=0.752,A260=0.723蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45XA280-0.74XA260=0.555mg/ml總蛋白量：0.555X50=27.75mgY1=E1/K1XMwtX3XVml=14.47mgY2=E2/K2XM：X3XVml=6.58mg產(chǎn)率=（（Y]+y2）/2]/M=54.65mg/kg純度%=（Y1+Y2）/2]/總蛋白量=37.93%3.2測定產(chǎn)品的分光光度吸收值

1.0000.600圖1氧化型細胞色素C分光光度吸收值0.8000.4000.2000.000波長系列11.0000.600圖1氧化型細胞色素C分光光度吸收值0.8000.4000.2000.000波長系列1氧化型的最大吸收峰在410毫微米，530毫微米。圖2還原型細胞色素C分光光度吸收值系列1波長還原型最大吸收峰在415毫微米，520毫微米及550毫微米。3.3細胞色素C的電泳結(jié)果的顯示如圖3.4分子量測定L單位：厘米L11Rf13.4分子量測定L單位：厘米L11Rf10.149L總6.7L21.6Rf20.239L32.5Rf30.373L43.6Rf40.537L54.4Rf50.657L65.4Rf60.806L4.5Rf0.672標(biāo)準蛋白分子的質(zhì)量成分分子質(zhì)量分子質(zhì)量對數(shù)值牛血清白蛋白662004.821兔肌動蛋白430004.633牛碳酸酐酶310004.491胰蛋白酶抑制劑201004.303雞蛋清溶菌酶144004.158多肽62003.792所測細胞色素C的R戶0.672，由所繪圖可得細胞色素C的分子量Mt=11541.929。分析討論4.1本次實驗所得的豬心細胞色素C的產(chǎn)率、純度均較好。在本次實驗過程中應(yīng)盡可能除掉豬心中的韌帶、脂肪和積血；使用離心機之前，一定要配平；透析之前要檢查透析袋。在制備分離膠時不可用玻璃棒攪拌。4.2細胞色素C的分子量約為13000,肽鏈中含有19個賴氨酸殘基，為一堿性蛋白,等電點(10.5?10.8)高，易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。4.3離子交換樹脂，是一種具有離子交換能力的高分子化合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。在離子交換過程中，溶液中的細胞色素C帶正電從溶液中擴散到交換樹脂的表面，然后穿過表面，又擴散到交換樹脂顆粒內(nèi)，這些離子與交換樹脂中的離子互相交換，交換出來的離子擴散到交換樹