常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用-課件

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology2020/10/281分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique2020/10/282精品資料2020/10/283核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理2020/10/284復(fù)性RNADNA2020/10/285（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。2020/10/286用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)2020/10/287二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。2020/10/288其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)2020/10/289三種印跡技術(shù)的比較2020/10/2810分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③2020/10/2811放射自顯影照片2020/10/2812DNA芯片技術(shù)2020/10/2813PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology2020/10/28145Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

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5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理555555552020/10/2815Cycle355

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525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。2020/10/2816PCR技術(shù)原理示意圖2020/10/2817PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C2020/10/2818模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分2020/10/2819利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆2020/10/2820利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變2020/10/2821將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析2020/10/2822逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)2020/10/2823原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)2020/10/2824（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。2020/10/2825實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'2020/10/2826實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法2.分子信標(biāo)探針法3.FRET探針法2020/10/2827圖20-3TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖2020/10/2828基因文庫(kù)GeneLibrary2020/10/2829基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。2020/10/2830一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。2020/10/2831基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選2020/10/2832第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例2020/10/2833cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫(kù)2020/10/2834生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique2020/10/2835是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)2020/10/2836基因芯片工作流程示意圖2020/10/2837是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理2020/10/2838生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy2020/10/2839一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)2020/10/2840標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。2020/10/2841標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖2020/10/2842（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途2020/10/2843酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。2020/10/2844（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理和用途免疫沉淀（immunoprecipitationIP）免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。CO-IP與質(zhì)譜分析以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白2020/10/2845免疫沉淀原理圖解2020/10/2846免疫共沉淀原理圖解2020/10/2847免疫共沉淀原理圖解蛋白A，蛋白B抗A抗體C進(jìn)行洗脫抗B抗體D進(jìn)行驗(yàn)證IPCACO-IPCA+BD2020/10/2848CO-IP與質(zhì)譜分析流程2020/10/2849電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定2020/10/2850放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針10X凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖2020/10/2851染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法2020/10/2852染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖2020/10/2853二、RNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNABindingProteinImmunoprecipitation，RIP），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。應(yīng)用范圍：研究蛋白與DNA動(dòng)態(tài)作用研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用2020/10/2854激光共聚集顯微鏡應(yīng)用技術(shù)LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM)2020/10/2855激光經(jīng)放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時(shí)，焦平面上被激光掃描的點(diǎn)F所發(fā)出的一定波長(zhǎng)的熒光通過檢測(cè)針孔光欄達(dá)到檢測(cè)器，并成像于顯示器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖2020/10/2856人眼及各類顯微鏡分辯率人眼分辯率0.20mm光學(xué)顯微鏡分辯率0.25um共焦顯微鏡分辯率0.18um電子顯微鏡分辯率0.20nm激光共聚焦顯微鏡有四個(gè)熒光通道，一個(gè)透射光通道2020