基因工程步驟23146課件

基因工程的基本步驟1編輯ppt基因操作的基本步驟2編輯ppt基因工程的基本過程3編輯ppt基因操作的基本步驟1）獲得目的基因（目的基因的獲取

）2）制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建

）3）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）4）篩選重組細(xì)胞5）實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)目的基因的檢測(cè)和表達(dá)4編輯ppt目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶(一）獲得目的基因5編輯ppt目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法6編輯ppt1）鳥槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(散彈射擊法、直接分離法)7編輯ppt用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個(gè)個(gè)片段，然后將這些片段隨機(jī)地連接在某些質(zhì)?；蚱渌d體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞的增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克?。?dāng)這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時(shí)，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。8編輯ppt9編輯ppt基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較10編輯ppt以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2）反轉(zhuǎn)錄法：11編輯ppt3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成12編輯ppt上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡單基因13編輯ppt哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：2）PCR技術(shù)：對(duì)提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增。14編輯pptPCR可以把指定的基因片段數(shù)量放大染色體PCR

基因放大連瑣反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)15編輯ppt2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR技術(shù)16編輯ppt（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建17編輯ppt基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)18編輯ppt啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動(dòng)子RNA聚合酶19編輯ppt終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來20編輯ppt目的基因載體限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連基因組√21編輯ppt（三）目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)22編輯ppt方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞23編輯ppt1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍24編輯ppt2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（2）程序：25編輯ppt2.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：26編輯ppt（四）目的基因的檢測(cè)和表達(dá)四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因初選27編輯ppt再次檢測(cè)檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原—抗體雜交28編輯ppt29編輯ppt不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。30編輯ppt多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。31編輯ppt從蘇云金芽苞桿菌中提取抗蟲基因從土壤農(nóng)桿菌中提取帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒同一種限制酶處理抗蟲基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌篩選將土壤農(nóng)桿菌與棉花細(xì)胞混合培養(yǎng)侵染重組質(zhì)粒將抗蟲基因?qū)朊藁?xì)胞并整合到棉花的DNA上植物組織培養(yǎng)獲得抗蟲棉抗蟲棉的培育流程圖：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法32編輯ppt重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因DNA連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝帶重組體的宿主篩選表型篩選DNA分子雜交鑒定個(gè)體水平抗原抗體反應(yīng)33編輯ppt1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)34編輯ppt2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)35編輯ppt3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習(xí)36編輯ppt4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習(xí)37編輯pp