唑來膦酸輔助治療骨巨細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)研究與臨床新方法的初步應(yīng)用

唑來膦酸輔助治療骨巨細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)研究與臨床新方法的初步應(yīng)用背景骨巨細(xì)胞瘤是常見的原發(fā)性骨腫瘤之一多數(shù)研究者認(rèn)為其為一種來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的良性骨腫以局部骨質(zhì)破壞為主要特其中少數(shù)病例還可發(fā)生“良性”肺轉(zhuǎn)移。目前研究顯骨巨細(xì)胞瘤對(duì)傳統(tǒng)的放療及化療不敏手術(shù)治療仍然是骨巨細(xì)胞瘤最主要的治療方式。術(shù)后高復(fù)發(fā)率是骨巨細(xì)胞瘤治療最大的挑戰(zhàn)。為手術(shù)徹底清除腫瘤病臨床醫(yī)生曾經(jīng)嘗試在術(shù)中使用多種化學(xué)試劑或物理方法輔助治進(jìn)行病灶刮除術(shù)后囊壁的處清除殘留的腫瘤細(xì)從而減少骨巨細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)病灶刮除囊壁高速磨除加骨水泥填充目前被認(rèn)為是骨巨細(xì)胞瘤手術(shù)治療的標(biāo)準(zhǔn)方式。隨著對(duì)骨巨細(xì)胞瘤疾病的深入研雙膦酸鹽類及RA克隆抗體輔助治療成為近年來骨巨細(xì)胞瘤治療的新進(jìn)展雙膦酸鹽早期是作為一類抗代謝骨病藥物進(jìn)入市它通過與焦磷酸的類似結(jié)發(fā)揮抗骨吸收的作用。在臨床應(yīng)用于骨巨細(xì)胞瘤輔助治療的研究取得了良好的效果。在體外實(shí)驗(yàn)研究中人們發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽類不僅可抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸延緩破骨細(xì)胞生成和成熟并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋而且能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。我們?cè)趯?duì)新一代雙膦酸鹽藥物唑來膦酸對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞的直接作用的研究中觀察其不僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的成骨分通過這兩種方式而發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用這一結(jié)論也解釋了臨床上報(bào)導(dǎo)的雙膦酸鹽輔助治療骨巨細(xì)胞瘤后病灶周圍明顯骨化形成的現(xiàn)也為骨骼相關(guān)事件的降低提供理論依據(jù)。在證實(shí)雙膦酸鹽具有誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞分化這一重要的抗腫瘤方式后進(jìn)一步研究雙膦酸鹽的濃度及誘導(dǎo)作用時(shí)間與其成骨誘導(dǎo)效應(yīng)的相關(guān)性可能具有重要的臨床意義在分子生物學(xué)水平深入探索雙膦酸鹽如何通過激活信號(hào)通路而誘發(fā)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化也將為人們更進(jìn)一步了解其生物學(xué)規(guī)律并促進(jìn)其抗腫瘤效應(yīng)具有重要意義。此外目前臨床醫(yī)生嘗試了雙膦酸鹽輔助治療骨巨細(xì)胞瘤的不同途徑和方式,我們也報(bào)道了常規(guī)術(shù)后雙膦酸鹽靜脈輔助治療方式的療效根據(jù)手術(shù)治療骨巨細(xì)胞瘤的特點(diǎn)尋找更加安全有效的輔助用藥途徑和方也將可能對(duì)提高腫瘤的療效發(fā)揮重要的意義。目的]討唑來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的最佳濃度及作用時(shí)間。2)討唑來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化機(jī)制。3)討臨床上應(yīng)用雙膦酸鹽類輔助治療骨巨細(xì)胞瘤的新方式及可行性方法]來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的濃度及時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來自201月至20月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院及南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院收治的例四肢骨巨細(xì)胞瘤患者。其中男性例女性例,年齡133歲。腫瘤影像學(xué)分級(jí)按Campa其中Ⅱ級(jí)例Ⅲ級(jí)例。所有患者術(shù)前均未接受雙膦酸鹽藥物輔助治術(shù)后均經(jīng)過病理診斷為骨巨細(xì)胞瘤。對(duì)術(shù)中切除的骨巨細(xì)胞瘤新鮮組織進(jìn)行原代培待骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)次傳代純化后分別給予含有不同濃度唑來膦酸(0M,0.01μμMμ5M,30)養(yǎng)基培養(yǎng)處理7小時(shí)后采用qRT測(cè)各組骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)基因cbfa-1tteocalnSPSS統(tǒng)計(jì).0學(xué)軟件將各組cbf、ostteocalcin值進(jìn)行單因素方差分析(one-wa分組間多重比較采用LSD。est再采用μ唑來膦酸與空白對(duì)照培養(yǎng)基分別行骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),處理4小時(shí)后給予細(xì)胞爬片ALP色及BCollTyOsteoectinOsteo色檢測(cè)。另于誘導(dǎo)后小時(shí)、2小時(shí)、7小時(shí)及168小時(shí)行qRT-PCR測(cè)兩組骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞cbf、o1trixosteocalcin。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析唑來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的最佳濃度及作用時(shí)間2)來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的信號(hào)途徑實(shí)驗(yàn)研究。取原代培養(yǎng)并已純化的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分組為對(duì)照組誘導(dǎo)組和信號(hào)抑制組1,照組采用常規(guī)培養(yǎng)液誘導(dǎo)組加入μ濃度的唑來膦酸,信號(hào)抑制組和在加入唑來膦酸前2加入J號(hào)抑制劑SP600μM)(1ERK號(hào)抑制劑PD98059組3同時(shí)加入SP60及9059處理3分鐘后采用Westen交檢測(cè)p-JNK,JNK,p-ERK,ERK各組骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)采用同樣的實(shí)驗(yàn)分組的處理方法,時(shí)后,采用qRT-PCR測(cè)各組細(xì)胞cbfa-1tteocalcin。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同前。分析雙膦酸鹽是否通過激活JKE路即信號(hào)通路的磷酸化發(fā)揮成骨分化誘導(dǎo)作用。3)膦酸鹽輔助治療骨巨細(xì)胞瘤新方式的可行性探索數(shù)字化復(fù)合抗骨巨細(xì)胞瘤珊瑚羥基磷灰石／聚乳酸(CHA制備及性能探索：首先利用計(jì)算機(jī)輔助3打印將按一定比例混合的C末與聚乳酸(P成具有特定外形珊瑚羥基磷灰石聚乳酸人工骨支架通過浸泡后真空凍干燥等處理將唑來膦酸鈉載入。將復(fù)合人工骨支架浸入細(xì)胞培養(yǎng)液收集6h12hh7提液。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(M及Annexin流式細(xì)胞定量分析法檢測(cè)不同時(shí)期浸提液對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞的增值影響及凋亡誘導(dǎo)作用。分析局部使用雙膦酸鹽的有效性。采用局部灌洗法輔助治療骨巨細(xì)胞1例的觀察：廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院例左股骨下段骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患給予再次囊內(nèi)病灶刮除骨水泥填充手術(shù)術(shù)中采用唑來膦酸溶液(2mg/)后4小時(shí)內(nèi)給予病灶內(nèi)唑來膦酸溶液(2mg/流。觀察患者一般情切口引流及愈合情況。術(shù)后定期病情復(fù)查。初步觀察局部灌洗法可能存在的安全性通過雙膦酸鹽的臨床新方法的初步應(yīng)用觀察探索其不同應(yīng)用方式的可行為進(jìn)一步大樣本臨床應(yīng)用和療效觀察提供指導(dǎo)。進(jìn)一步促進(jìn)骨巨細(xì)胞瘤的治療效果結(jié)果]來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的濃度及時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)顯示μ唑來膦酸組中成骨分化相關(guān)基因表達(dá)最明顯4小時(shí)后μM唑來膦酸組cbfa-1tteo分別是對(duì)照組2.倍、2.倍及2.倍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P=-0.002,<0.001,<此外,0.唑來膦酸組cbf基因表達(dá)是對(duì)照組1具有顯著性差異(P=0膦酸誘導(dǎo)4小時(shí)后骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞A色及BPCollage、oocalcin色與對(duì)照組相比表現(xiàn)。在誘導(dǎo)后2小時(shí)誘導(dǎo)組cbf因表達(dá)與對(duì)照組具有顯著性差異(P<；在監(jiān)測(cè)點(diǎn)誘導(dǎo)組與對(duì)照組ostteocalcin因表達(dá)均具有顯著性差異(P=0.00在測(cè)點(diǎn)誘導(dǎo)組與對(duì)照組cbf、-1tteocalcin分別增高8.1,33.3均具有顯著性差異(P=0.002,0細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成。采用了Wes交檢測(cè)ERK,JNK,p-ERK,p-JNK胞見ERK,JNK,p-ERK,p-JNK同時(shí)加入兩組阻斷劑后JKE白表達(dá)明顯降低。在處理7小時(shí)后,單純?chǔ)踢騺盱⑺嵴T導(dǎo)組組osteocalcin照組及信號(hào)抑制組1,2,3均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.001,=0.0070.001),cb組及信號(hào)抑制組1,3有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P).013。0.008)唑來膦酸誘導(dǎo)組cbf、ostteocalcin分別是SP600125抑制組的8051.、4.倍。Cbfa-1,、sterixalcin的基因表達(dá)信號(hào)抑制組1,照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P>0.05)Osterix表達(dá)中,μ唑來膦酸誘導(dǎo)組與對(duì)照組無顯著性差異(P=-0；但與cbf、osteocalcin差異(P=0.04.005)。3打印技術(shù)可制備個(gè)體化復(fù)合抗骨巨細(xì)胞瘤珊瑚羥基磷灰石／聚乳酸(CHA制備材料經(jīng)過7小時(shí)、4小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)及小時(shí)后提取浸提液在原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞中予不同時(shí)期的復(fù)合唑來膦酸人工骨浸提液,時(shí)后見細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組減少部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化細(xì)胞外形發(fā)生皺縮偽足減少部分梭形基質(zhì)細(xì)胞改變?yōu)閳A形或橢圓形的形狀,在早期的浸提液中最為明顯。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(M檢測(cè)不同時(shí)期浸提液對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞的增值影結(jié)果顯示復(fù)合唑來膦酸人工骨浸提液對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞抑制較陰性培養(yǎng)基對(duì)照組顯著增強(qiáng)4小時(shí)內(nèi)早期高濃度唑來膦酸浸提液對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞增殖具有明顯抑制作與對(duì)照組浸提液有顯著性差異(P<0.001,0.0。1,0.001,=0.002)4小時(shí)后浸提液抑制作用減弱并與前2小時(shí)有顯著性差異(P=0.007,0浸提液同樣表現(xiàn)出很強(qiáng)的的誘導(dǎo)凋亡的能力,Annexin染IC細(xì)胞儀定量分析結(jié)果顯示對(duì)照組、7小時(shí)4小時(shí)2小時(shí)1小時(shí)及小時(shí)浸提液組原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞凋亡占總數(shù)細(xì)胞的百分比均值依次為1.5%..3%..95%及12.79%局部唑來膦酸灌洗法預(yù)防骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)安全性的病例觀察術(shù)中多功能引流管置于病灶周圍。術(shù)后灌洗引流管引流通暢總引流液約90m1術(shù)后4小時(shí)拔出引流管?；颊呶窗l(fā)生流感樣癥狀及腎功能異常。1天后手術(shù)切口拆線愈合狀況良好唑來膦酸溶液局部灌洗治療隨訪未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)并發(fā)癥。結(jié)論]膦酸鹽對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡及成骨分化的雙重作用。其作用方式可能于藥物濃度相低濃度唑來膦酸可能具有較強(qiáng)的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)潛能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。在體外實(shí)驗(yàn)中,μ濃度唑來膦酸具有最強(qiáng)的誘導(dǎo)分化能力。因此維持低劑量唑來膦酸輔助治療骨巨細(xì)胞瘤能夠誘導(dǎo)殘留腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分化避免了骨巨細(xì)胞瘤手術(shù)中不必要的切除促進(jìn)病灶周圍骨結(jié)構(gòu)的強(qiáng)化或重建減少術(shù)后骨折等并發(fā)癥還可能減少高濃度輔助用藥的全身性副作用。2唑來膦酸誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨分化呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)時(shí)間越久骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨分化現(xiàn)象越明顯。臨床雙膦酸鹽類藥物的使用較方便,可定期靜脈或口服用藥。在避免發(fā)生重大并發(fā)癥的基礎(chǔ)上圍手術(shù)期可維持低劑量唑來膦酸治療發(fā)揮持續(xù)抗腫瘤作用。輔助治療時(shí)間越久術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率可能越低。3)號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化及生長(zhǎng)增殖等多種生理過程發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)證明唑來膦酸也可能激活JKE白磷酸化阻斷JKERK信號(hào)通路能夠降低唑來膦酸誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達(dá)因此唑來膦酸可能是通過JKE號(hào)通路的激活來誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。通過對(duì)骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨分化機(jī)制的深入研究為新型輔助用藥的使用及提高成骨誘導(dǎo)效應(yīng)提供新途徑4)字化復(fù)合抗骨巨細(xì)胞瘤珊瑚羥基磷灰石聚乳酸(CHA為骨巨細(xì)胞瘤病灶清除術(shù)后的骨質(zhì)缺損提供個(gè)性化支撐其制作方便快捷。同時(shí)唑來膦酸在洗脫支架周圍局部釋放早期可提高局部藥物濃度對(duì)殘留骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。隨著唑來膦酸藥物降低可持續(xù)發(fā)揮抗骨質(zhì)吸收及促進(jìn)腫瘤基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)作用促進(jìn)病灶內(nèi)骨結(jié)構(gòu)的強(qiáng)固或重建,減少骨折等并發(fā)癥的發(fā)生率。局部使用數(shù)字化人工骨復(fù)合唑來膦酸為骨巨細(xì)胞