羅伊氏乳桿菌代謝添加方法

精品文檔-下載后可編輯羅伊氏乳桿菌代謝添加方法1前言

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是衛(wèi)生部于2022年批準(zhǔn)的新型益生菌，該菌常棲息于人和動(dòng)物的腸道系統(tǒng)中，其代謝產(chǎn)物可抑制其它微生物的生長(zhǎng)，因此引起廣泛研究興趣，在生物防腐劑[1,2]、生物滅菌劑[3]、口香糖添加劑[4]和抗感染治療劑[5]等方面應(yīng)用的研究層出不窮。羅伊氏乳桿菌具抑菌特性的主要原因在于其代謝甘油過(guò)程中形成的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛(3-HPA)，該物質(zhì)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌、病原蟲(chóng)、原生動(dòng)物等的生長(zhǎng)[6~8]。甘油在微生物體內(nèi)一般經(jīng)依賴(lài)于輔酶B12的甘油脫水酶[9]轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，3-羥基丙醛在依賴(lài)于輔酶NADH的1,3-丙二醇脫氫酶作用下會(huì)進(jìn)一步還原為1,3-丙二醇(1,3-PD)，因此微生物一般不向胞外分泌3-羥基丙醛，而是直接在胞內(nèi)進(jìn)一步代謝成1,3-丙二醇后分泌出胞外。羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)是目前發(fā)現(xiàn)的可向胞外分泌較多3-羥基丙醛的菌株，該菌廣泛分布于人及動(dòng)物的腸道[10~13]。Peng等[14]對(duì)培養(yǎng)基的研究表明，用葡萄糖、甘油及混合碳源分別培養(yǎng)L.reuteri，發(fā)現(xiàn)其不能以甘油為唯一碳源生長(zhǎng)；在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，無(wú)3-羥基丙醛生成；在葡萄糖和甘油的混合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，才會(huì)生成3-羥基丙醛和1，3-丙二醇。因此研究甘油的添加策略對(duì)L.reuteri分泌3-羥基丙醛和1,3-丙二醇的影響具有重要意義。本文針對(duì)細(xì)胞不同生長(zhǎng)期添加甘油，考察L.reuteri代謝過(guò)程中葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油、3-HPA和1,3-PD濃度隨時(shí)間的變化情況，分析了甘油添加時(shí)機(jī)對(duì)代謝的影響。在研究基礎(chǔ)上，通過(guò)選擇甘油添加策略調(diào)節(jié)L.reuteri代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)3-HPA，可為環(huán)境微生物和食品微生物中常采用的混菌培養(yǎng)過(guò)程中控制其它微生物的水平，提供必要的指導(dǎo)；同時(shí)研究結(jié)果對(duì)共底物培養(yǎng)生產(chǎn)3-HPA和1,3-PD也有實(shí)際的參考意義。

2實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1菌種與試劑羅伊氏乳桿菌(L.reuteriCG001)，由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏于?80℃的甘油管中，甘油管為含6%脫脂奶粉和10%甘油的溶液。使用時(shí)，羅伊氏乳桿菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u瓶轉(zhuǎn)速200r?min?1厭氧培養(yǎng)15h待用。所用試劑均為市售分析純。

2.2羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件酵母膏濃度20g?L?1，葡萄糖濃度20g?L?1，檸檬酸銨濃度1g?L?1，醋酸鈉濃度7g?L?1，磷酸氫二鉀濃度3g?L?1，硫酸錳0.18g?L?1，硫酸鎂0.2g?L?1，吐溫801g?L?1。初始pH5.5，培養(yǎng)溫度37℃，批式培養(yǎng)接種量為2%，連續(xù)通氮?dú)獗ＷC厭氧環(huán)境。所用發(fā)酵罐為Biostat5(B.Braun,Germany)，工作體積為5L，pH、溫度、攪拌速度自動(dòng)控制，為保證厭氧環(huán)境，通氣速率為0.2vvm(指單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位液體體積的氣體體積)。

2.3添加甘油策略的研究(1)在發(fā)酵初始時(shí)加入甘油：在發(fā)酵初始時(shí)加入葡萄糖(30mmol?L?1)和甘油(200mmol?L?1)，作為共底物，其它培養(yǎng)基組成不變，在pH=5.5、37℃、150r?min?1下開(kāi)始厭氧培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化，每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)菌濃及代謝物的濃度。(2)在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期加入甘油：按優(yōu)化過(guò)的MRS培養(yǎng)基配發(fā)酵液，發(fā)酵罐pH=5.5、37℃、150r?min?1厭氧條件下培養(yǎng)8h后，補(bǔ)加200mmol?L?1甘油于發(fā)酵液，開(kāi)始轉(zhuǎn)化，在發(fā)酵和轉(zhuǎn)化過(guò)程中取樣檢測(cè)3-HPA和各代謝物的變化情況。(3)在細(xì)胞生長(zhǎng)靜止期加入甘油：按優(yōu)化過(guò)的MRS培養(yǎng)基配發(fā)酵液，發(fā)酵罐pH=5.5、37℃、150r?min?1厭氧條件下培養(yǎng)20h后，經(jīng)檢測(cè)葡萄糖基本消耗完全，補(bǔ)加200mmol?L?1甘油于發(fā)酵液，開(kāi)始轉(zhuǎn)化，在發(fā)酵和轉(zhuǎn)化過(guò)程中取樣檢測(cè)3-HPA和各代謝物的變化情況。

2.4菌濃的測(cè)定羅伊氏乳桿菌濃度由濁度法測(cè)定。預(yù)先建立菌濃與600nm處吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定600nm處吸光值對(duì)應(yīng)出菌濃。

2.5葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油和1,3-丙二醇的測(cè)定葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油和1,3-丙二醇的測(cè)定使用AgilentHPLC1100.分離條件為：AminexHPX-87H柱，60℃下操作，5mmol?L?1H2SO4為洗脫液，流速為0.6mL?min?1，檢測(cè)器為折光示差檢測(cè)器[14,15]。2.63-羥基丙醛的檢測(cè)3-HPA無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，采用衍生化比色法測(cè)定[15,16]。衍生液為0.05mmol?L?1溶解的色氨酸溶液，濃度為10mmol?L?1。每毫升樣品加入0.75mL衍生液，然后加入3mL37%鹽酸溶液，37℃溫浴20min，測(cè)560nm處吸光值。以丙烯醛為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)液中3-HPA濃度可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。3結(jié)果與討論

3.1不添加甘油發(fā)酵圖1是L.reuteriCG001在厭氧條件下，葡萄糖為唯一碳源時(shí)的代謝曲線，乳酸、乙酸、乙醇是主要代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)為典型的異型乳酸代謝特征。通過(guò)JGI(/cgi-bin/pub/main.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)?cè)摼拇x途徑可知，L.reuteri通過(guò)5-磷酸木酮糖途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸、乙醇。圖1結(jié)果顯示，該菌在厭氧條件下，經(jīng)12h發(fā)酵進(jìn)入靜止期，最終菌濃約為1.5g?L?1左右；消耗的葡萄糖主要生成乳酸和乙醇，葡萄糖約經(jīng)16h被完全轉(zhuǎn)化，生成乳酸和乙醇濃度分別約為12.6g?L?1和4.0g?L?1，乙酸濃度變化很小。

3.2發(fā)酵初始添加甘油作為共底物圖2是在發(fā)酵初始時(shí)加入葡萄糖(30mmol?L?1)和甘油(200mmol?L?1)厭氧條件下培養(yǎng)時(shí)，菌濃、底物及相應(yīng)代謝物濃度隨時(shí)間的變化曲線。由圖2可知，在甘油與葡萄糖作為共底物培養(yǎng)時(shí)，其代謝特征與葡萄糖為唯一碳源時(shí)差別較大。經(jīng)6h發(fā)酵，細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期基本完成，大部分葡萄糖被消耗，殘余葡萄糖濃度為0.5g?L?1，生成菌體濃度約為0.9g?L?1，生成乳酸3g?L?1，凈生成乙酸約1g?L?1，生成乙醇0.4g?L?1，因此可見(jiàn)其代謝向乙酸途徑遷移。在前2h甘油代謝同時(shí)生成3-HPA和1,3-PD，之后3-HPA濃度逐漸趨于0，而1,3-PD濃度高達(dá)38mmol?L?1，3-HPA與1,3-PD濃度的變化反映了胞內(nèi)NADH的情況，在NADH較充足的情況下易生成1,3-PD，而菌在前6h生成了較多的乙酸，正反映了其代謝從乙醇途徑遷移的過(guò)程。乙醇途徑每生成1mol乙醇消耗2molNADH，而代謝遷移到乙酸途徑后，結(jié)余的NADH促進(jìn)1,3-丙二醇脫氫酶轉(zhuǎn)化3-HPA向1,3-PD的過(guò)程，因此生成較多的1,3-PD。因此L.reuteri菌胞內(nèi)NADH會(huì)優(yōu)先用于甘油途徑。6h后細(xì)胞迅速開(kāi)始衰亡，可能是乙酸和3-HPA對(duì)微生物的致死作用導(dǎo)致，此后殘余的葡萄糖的緩慢消耗用于微生物的活性維持，由于NADH被1,3-丙二醇脫氫酶途徑轉(zhuǎn)化為NAD，胞內(nèi)的NADH/NAD下降，從而細(xì)胞又積累了8mmol?L?1的3-HPA，加速了細(xì)胞的死亡。

3.3在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期加入甘油厭氧條件下培養(yǎng)8h后，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入甘油，各代謝物濃度的變化情況如圖3所示。甘油立即開(kāi)始消耗，生成3-HPA和1,3-PD，但3-HPA生成速率小于1,3-PD；葡萄糖消耗速率降低，乙酸和乳酸緩慢生成，乙醇濃度幾乎不變。因此推斷在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入甘油后，L.reuteri立即由乙醇途徑向乙酸途徑遷移，以適應(yīng)甘油途徑對(duì)NADH的需求。12h后補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，甘油和葡萄糖的消耗速率均加快，生成1,3-PD和乳酸的速率也加快，并表現(xiàn)出一定的同步性；而3-HPA濃度迅速降低到檢測(cè)不出。經(jīng)24h培養(yǎng)，菌濃高達(dá)1.75g?L?1。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入甘油會(huì)引起代謝途徑的緩慢遷移，細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)后，會(huì)迅速采取對(duì)自己生存最合理的方式來(lái)調(diào)節(jié)代謝，產(chǎn)生最少的3-HPA，調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD的比例以適應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此在殘余較多葡萄糖的對(duì)數(shù)期加入甘油，細(xì)胞并不會(huì)積累較多的3-HPA，不利于其抑菌作用的發(fā)揮。3.4在細(xì)胞生長(zhǎng)靜止期加入甘油厭氧條件下培養(yǎng)20h后，在細(xì)胞生長(zhǎng)靜止期加入甘油，各代謝物濃度的變化情況如圖4所示。細(xì)胞在培養(yǎng)12h后，菌濃1.3g?L?1左右，之后菌濃基本不變，在16h后培養(yǎng)基中的葡萄糖基本消耗完全，在細(xì)胞生長(zhǎng)靜止期(20h)加入甘油，之后2h內(nèi)，3-HPA濃度達(dá)到最高約20mmol?L?1，1,3-PD濃度達(dá)到約13mmol?L?1。而同時(shí)乳酸濃度約下降3g?L?1，乙酸濃度約增加1.7g?L?1，乙醇濃度約增加1g?L?1，因此有乳酸重新進(jìn)入代謝途徑。由乳酸到乙酸的代謝途徑可知，該過(guò)程中每摩爾乳酸可生成1mol乙酸，并同時(shí)生成2molNADH，生成的NADH可用于3-HPA向1,3-PD過(guò)程的轉(zhuǎn)化所需。而乳酸到乙醇代謝途徑表明，每摩爾乳酸可生成1mol乙醇，但此過(guò)程不會(huì)有NADH生成。圖中同樣可以看出在20h后隨著3-HPA的生成，菌濃逐步下降，這與3-HPA對(duì)L.reuteri菌自身的致死效應(yīng)相吻合。因此若希望積累較多的3-HPA提高其抑菌特性，在靜止期加入甘油應(yīng)是較好的選擇，但較高的甘油濃度可能對(duì)該過(guò)程并不利。為生成較多的3-HPA并避免其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，有效的甘油添加策略應(yīng)是在靜止期添加低濃度甘油，在自身菌濃降低到一定程度時(shí)，重新補(bǔ)加葡萄糖，以促進(jìn)菌濃的恢復(fù)，通過(guò)批式交替補(bǔ)料以維持L.reuteri菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)3-HPA，并維持在一定濃度，從而抑制其它微生物的生長(zhǎng)。

4結(jié)論

在發(fā)酵罐中厭氧培養(yǎng)L.reuteriCG001，呈現(xiàn)典型的異型乳酸發(fā)酵特征，細(xì)胞在12h后進(jìn)入靜止期。通過(guò)在細(xì)胞不同生長(zhǎng)期加入甘油的考察結(jié)果表明，L.reuteri在以甘油和葡萄糖作為共同培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞代謝會(huì)向凈生成NADH的途徑遷移，以滿(mǎn)足甘油向1,3-PD轉(zhuǎn)化途徑中NADH的需求，從而盡量減少分泌3-HPA造成對(duì)自身的傷害。在對(duì)數(shù)期加入甘油，胞外檢測(cè)到的3-HPA極少，若葡萄糖過(guò)量，基本在胞外檢測(cè)不到3-