分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)第1頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一、分子生物學(xué)概念

（一）基本概念

（二）基因的堿基順序與蛋白質(zhì)的氨基酸順序

（三）基因的結(jié)構(gòu)

（四）基因的表達(dá)與調(diào)控

第2頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（一）基本概念

基因：是編碼蛋白質(zhì)或RNA分子遺傳信息的基本遺傳單位。從化學(xué)角度觀察，基因則是一段具有特定功能和結(jié)構(gòu)的連續(xù)的脫氧核糖核酸序列，是構(gòu)成巨大遺傳單位染色體的重要組成部分。

順?lè)醋樱喉樂(lè)醋雍突蜻@兩個(gè)術(shù)語(yǔ)是互相通用的。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)順?lè)醋蛹仁且粋€(gè)基因，大約含有1500個(gè)核苷酸對(duì)，是由一群突變單位和重組單位組成的線性結(jié)構(gòu)。第3頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月因此，順?lè)醋痈拍畋砻鳎夯虿皇亲钚挝?，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸區(qū)段才是基因的編碼區(qū)。

每一個(gè)順?lè)醋泳褪且欢魏塑账嵝蛄?，或者是一個(gè)基因的DNA或RNA單元，它編碼一種完整的多肽鏈。順?lè)醋邮枪δ軉挝?，它是由許多可以突變的位點(diǎn)組成的，而這些位點(diǎn)之間又可以發(fā)生交換。

多體蛋白質(zhì)（multimericproteins）：由數(shù)個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)。第4頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月同型多體蛋白質(zhì)：在多體蛋白質(zhì)中，如果所有的亞基都是同樣的，這種蛋白質(zhì)就屬于同型多體（homomultimer）蛋白質(zhì)，由一種基因編碼。

異型多體（heteromultimer）蛋白質(zhì)：亞基各不相同的蛋白質(zhì)，由多種基因編碼。如血紅蛋白。

第5頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）基因的堿基順序與蛋白質(zhì)的氨基酸順序

1.

中心法則（centraldogma）：既遺傳信息是從DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白質(zhì)

而遺傳信息從DNA直接到蛋白質(zhì)的傳遞，只是一種理論上的可能性，迄今尚未得到證實(shí)。

第6頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.密碼子：每3個(gè)堿基編碼一種氨基酸，就會(huì)編碼出64種（43=64）不同的氨基酸。蛋白質(zhì)分子是由20種不同的氨基酸構(gòu)成的，因此，1種氨基酸可有幾個(gè)不同的密碼子，既3個(gè)堿基甚至更多的堿基編碼一種氨基酸是必要的。

遺傳密碼是否重疊？研究證實(shí)：遺傳密碼是不重疊的。

三聯(lián)體之間是否存在著“逗號(hào)”？研究證實(shí)：堿基的閱讀是從一個(gè)固定的起點(diǎn)按序進(jìn)行的，不存在有什么“逗號(hào)”的問(wèn)題。

…QABCQDEFQGHIQJKLQ…第7頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）基因的結(jié)構(gòu)

基因的編碼區(qū)（即轉(zhuǎn)錄區(qū)）是連續(xù)不斷的序列，包括一個(gè)起始密碼子ATG和一個(gè)終止密碼子TAA。編碼區(qū)的兩側(cè)是轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)譯的側(cè)翼序列區(qū)，其中5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)簡(jiǎn)稱(chēng)5`UTR，含有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)；3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)簡(jiǎn)稱(chēng)3`UTR含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

無(wú)論是真核的基因還是原核的基因，都可劃分成編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個(gè)基本組成部分。

編碼區(qū)含有大量的可以被細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)譯機(jī)器閱讀的遺傳密碼，包括起始密碼子（通第8頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常是AUG）和終止密碼子（UAA，UAG或UGA）。非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)中的5`末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（5`UTR）和3`末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（3`UTR），對(duì)于基因遺傳信息的表述是必要的，但它們都不會(huì)被轉(zhuǎn)譯成多肽序列。

真核基因與原核基因的區(qū)別：

事實(shí)上，真核生物的基因都是以單順?lè)醋拥男问酱嬖?，因此它們編碼的也都是單基因產(chǎn)物。而大腸桿菌類(lèi)原核生物往往是多順?lè)醋?，它轉(zhuǎn)錄的是一種大分子量的mRNA，可同時(shí)編碼兩種甚至數(shù)種的基因產(chǎn)物。第9頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）基因的表達(dá)與調(diào)控

結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)：編碼細(xì)胞成份，如代謝酶類(lèi)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和細(xì)胞骨架成份等的基因。

調(diào)節(jié)基因（regulatorygene)：編碼控制其他基因表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。

操縱基因（operator):指接受來(lái)自調(diào)節(jié)基因合成的調(diào)節(jié)蛋白的作用，使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性得以抑制的特定的DNA區(qū)段，也稱(chēng)為控制單元。第10頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月儲(chǔ)藏在基因中的遺傳信息分轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯兩步進(jìn)行表達(dá)，這種遺傳信息從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的流向，在所有的細(xì)胞類(lèi)型中都是受到高度調(diào)節(jié)的，同時(shí)在有些情況下也是嚴(yán)格協(xié)同的。基因表達(dá)的此種嚴(yán)格調(diào)控機(jī)理，保證細(xì)胞不會(huì)浪費(fèi)能量用于合成它所不需要的基因產(chǎn)物。

從基因研究上，操縱子概念比順?lè)醋佑诌M(jìn)了一步。即基因不但在結(jié)構(gòu)上是可分的，而且在功能上也是有分工的。同時(shí)，有的基因控制蛋白質(zhì)產(chǎn)物的合成，而有的基因并沒(méi)有直接的產(chǎn)物。操縱子模型第11頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核酸探測(cè)技術(shù)

（一）指紋圖譜

（二）核酸分子雜交第12頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）、指紋圖譜

指紋圖譜：即核酸酶切圖譜，對(duì)生物的蛋白質(zhì)、DNA和RNA進(jìn)行分析的電泳圖、雜交放射性自顯影圖等。在微生物研究上，主要是用限制性?xún)?nèi)切酶（ERA）對(duì)病毒、細(xì)菌DNA進(jìn)行酶切分析的圖譜。

原理：在微生物（細(xì)菌）細(xì)胞中有1種限制性?xún)?nèi)切酶類(lèi)（II，稱(chēng)為RE），能特異性的識(shí)別和切割DNA鏈上特定的一段DNA片段，這類(lèi)酶廣泛應(yīng)用于基因工程的各個(gè)方面。

ERA就是用RE消化病毒或細(xì)菌的DNA或質(zhì)粒，將消化物于瓊脂凝膠中電泳分離，經(jīng)第13頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠（EB）染色，然后分析DNA酶切片段的數(shù)目、遷移率等分析微生物的變異現(xiàn)象、鑒定毒株、分型及了解基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)行流行病學(xué)研究等等。

方法：

1.DNA抽提

2.DNA酶切

3.電泳

4.染色

5.觀察、照相

6.分析

7.酶切圖譜

第14頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針技術(shù)

前言

(一)核酸探針的種類(lèi)

(二)核酸探針的制備

(三)核酸雜交

(四)核酸探針技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用第15頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月前言

化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(probe)，是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長(zhǎng)因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。

核酸探針技術(shù)原理是堿基配對(duì)?；パa(bǔ)的兩條核酸單鏈通過(guò)退火形成雙鏈，這一過(guò)程稱(chēng)為核酸雜交。（基本過(guò)程是：加熱變性第16頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月降溫復(fù)性。）核酸探針是指帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測(cè)核酸樣品中特定基因序列的檢測(cè)。每一種病原體都具有獨(dú)特的核酸片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。

第17頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(一)核酸探針的種類(lèi)

1.按來(lái)源及性質(zhì)劃分可將核酸探針?lè)譃榛蚪MDNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類(lèi)。

作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應(yīng)用最為廣泛，它的制備可通過(guò)酶切或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中，隨著質(zhì)粒的復(fù)制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。第18頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測(cè)。cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)粒或噬菌體中，以便大量制備。將信息RNA(mRNA)標(biāo)記也可作為核酸分子雜交的探針。但由于來(lái)源極不方便，且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應(yīng)用較少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應(yīng)用十分廣泛，可根據(jù)需要隨心所欲合成相應(yīng)的序列，可合成僅有幾十個(gè)bp的探針序列，對(duì)于檢測(cè)點(diǎn)突變和小段第19頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月堿基的缺失或插入尤為適用2.按標(biāo)記物劃分有放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針兩大類(lèi)。放射性標(biāo)記探針用放射性同位素做為標(biāo)記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應(yīng)用最廣泛的探針標(biāo)記物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應(yīng)用最普遍。放射性標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測(cè)到Pg級(jí)；缺點(diǎn)是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高等。因此，放射性標(biāo)記的探針不能實(shí)現(xiàn)商品化。目前，許多實(shí)驗(yàn)室都致力于發(fā)展非放射性標(biāo)記的探針。第20頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前應(yīng)用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素，對(duì)親和素有獨(dú)特的親和力，兩者能形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進(jìn)行檢測(cè)。地高辛是一種類(lèi)固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)，原理類(lèi)似于生物素的檢測(cè)。地高辛標(biāo)記核酸探針的檢測(cè)靈敏度可與放射性同位素標(biāo)記的相當(dāng)，而特異性?xún)?yōu)于生物素標(biāo)記，其應(yīng)用日趨廣泛。第21頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸探針的制備

1.DNA探針制備

（1）以病原細(xì)胞核或病毒中提取的特異性DNA，用理化學(xué)方法將其純化，然后再用限制性核酸酶將DNA切割成若干片段，電泳回收目的DNA；

（2）酶促反應(yīng)合成法，即從病原中提取mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的DNA（cDNA）；

（3）化學(xué)合成法，以單核苷酸為原料，人工合成DNA的某一片段。第22頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.RNA探針

全基因RNA探針可用RNA病毒的基因標(biāo)記即可；由DNA轉(zhuǎn)錄出探針RNA，可由RNA聚合酶獲得大量高純度的RNA，其靈敏度比DNA探針高出10多倍。

第23頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(三)核酸雜交

雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測(cè)核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡(jiǎn)稱(chēng)NC膜)或尼龍膜(nylonmembrane)。固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個(gè)基本過(guò)程：第一，通過(guò)印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號(hào)的檢測(cè)。第24頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用探針對(duì)細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測(cè)的方法稱(chēng)之為核酸原位雜交。某特點(diǎn)是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)。例如?？捎锰禺愋缘募?xì)菌、病毒的核酸做為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無(wú)該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨(dú)特的意義。第25頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月近年來(lái)液相雜交技術(shù)有所發(fā)展。液相雜交與固相雜交的主要區(qū)別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。液相雜交步驟有所簡(jiǎn)化，雜交速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。

各種雜交技術(shù)中，膜上印跡雜交技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，它由以下三個(gè)基本過(guò)程組成。1.核酸印跡技術(shù)

(1)斑點(diǎn)印跡(Dot-blot)將待測(cè)核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣在膜上，稱(chēng)之為斑點(diǎn)印跡。第26頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行80℃真空烘烤2h。

應(yīng)用斑點(diǎn)印跡技術(shù)，可在一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快速，在臨床診斷中應(yīng)用較廣。適合進(jìn)行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測(cè)基因的分子量。(2)Southern印跡(Southernblot)這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。常規(guī)處理如下，先用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將第27頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月得DNA片段按分子量大小分離，接著對(duì)凝膠進(jìn)行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對(duì)位置保持不變。用探針與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可鑒定待測(cè)DNA的大小、進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)等。

(3)Northern印跡(Northernblot)Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。RNA樣品經(jīng)第28頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡后進(jìn)行雜交反應(yīng)可鑒定其中特異mRNA分子的量與大小。

Northern印跡的方法與Southern印跡基本相同，可參照進(jìn)行。但RNA的變性方法與DNA不同。DNA樣品可先通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，再用堿處理凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性,因?yàn)閴A會(huì)導(dǎo)致RNA水解。因此，在Northern印跡前，須進(jìn)行RNA變性電泳，在電泳過(guò)程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移。RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛-二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理第29頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過(guò)程中變性而完全解離形成單鏈。2.雜交反應(yīng)的基本過(guò)程雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作。

預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測(cè)核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，以避免這些位點(diǎn)與探針的非特異性結(jié)合。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測(cè)核酸單鏈在一定溫第30頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過(guò)程。雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號(hào)的檢測(cè)。膜洗凈后,將繼續(xù)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。第31頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(四)核酸探針技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用

核酸探針技術(shù)是目前分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列的有力工具。核酸探針可用以檢測(cè)任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒(菌)株和寄生蟲(chóng)。目前，各種常見(jiàn)病毒病的診斷和研究都已應(yīng)用到核酸探針技術(shù)，這方面的研究報(bào)道數(shù)以萬(wàn)計(jì)且與日俱增。但該項(xiàng)技術(shù)的操作畢竟比常規(guī)方法復(fù)雜，費(fèi)用較高，在動(dòng)物檢疫中尚未推廣。多在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)病原作深入研究時(shí)使用。第32頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)由美國(guó)Centus公司的KaryMullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報(bào)道，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)。通過(guò)PCR可以簡(jiǎn)便、快速地從微量生物材料中以體外擴(kuò)增的方式獲得大量特定的核酸，并且有很高的靈敏度和特異性，可在動(dòng)物檢疫中用于微量樣品的檢測(cè)。

1.PCR的基本原理和過(guò)程PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的第33頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月條件下依賴(lài)于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR以欲擴(kuò)增的DNA做為模板，以和模板正鏈和負(fù)鏈末端互補(bǔ)的兩種寡聚核苷酸做為引物，經(jīng)過(guò)模板DNA變性、模板引物復(fù)性結(jié)合、并在DNA聚合酶作用下發(fā)生引物鏈延伸反應(yīng)來(lái)合成新的模板DNA。模板DNA變性、引物結(jié)合(退火)、引物延伸合成DNA這三步構(gòu)成一個(gè)PCR循環(huán)。每一循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又成為下一個(gè)循環(huán)的模板DNA。這樣，目的的DNA的數(shù)量將以2n-2n的形式累積，在2小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增30(n)個(gè)循環(huán)，DNA量達(dá)原來(lái)的上百萬(wàn)倍。第34頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR三步反應(yīng)中，變性反應(yīng)在高溫中進(jìn)行，目的是通過(guò)加熱使DNA雙鏈解離形成單鏈；第二步反應(yīng)又稱(chēng)退火反應(yīng)，在較低溫度中進(jìn)行，它使引物與模板上互補(bǔ)的序列形成雜交鏈而結(jié)合上模板；第三步為延伸反應(yīng)，是在4種dNTP底物和Mg2+

存在的條件下，由DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈的延伸反應(yīng)。通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個(gè)溫度的循環(huán)，模板上介于兩個(gè)引物之間的片段不斷得到擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增示意圖第35頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.PCR衍生技術(shù)PCR可擴(kuò)增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴(kuò)增cDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對(duì)稱(chēng)PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補(bǔ)PCR、免疫PCR和套式PCR等。

(1)反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT－PCR)

RT－PCR用于擴(kuò)增RNA樣品。在PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA做為PCR的模板，加入引物和TaqDNA聚合酶按正常第36頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR方式擴(kuò)增cDNA。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于RNA和RNA病毒的檢測(cè)。

(2)錨定PCR(AnchoredPCR)通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道欲擴(kuò)增DNA或RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。當(dāng)欲擴(kuò)增的片段序列未知時(shí)，可通過(guò)錨定PCR進(jìn)行擴(kuò)增。其基本方法是分離細(xì)胞總RNA或mRNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通過(guò)與其互補(bǔ)的錨定引物poly(dC)來(lái)保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。第37頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)反向PCR(InversePCR)常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩個(gè)已知序列之間的DNA片段，反向PCR則用于擴(kuò)增位于已知序列兩側(cè)的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段環(huán)化，再用限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī)PCR操作就可大量擴(kuò)增未知序列。

第38頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(4)不對(duì)稱(chēng)PCR(AsymmetricPCR)不對(duì)稱(chēng)PCR又稱(chēng)單鏈擴(kuò)增PCR。一般PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對(duì)稱(chēng)PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為50:1-100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會(huì)被用完，大量生成一條單鏈的DNA，分離單