可見(jiàn)紫外分光光度法

可見(jiàn)紫外分光光度法第1頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜第二節(jié)分光光度法基本原理第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法

第四節(jié)提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法第五節(jié)紫外分光光度法簡(jiǎn)介第2頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目的要求掌握分光光度法的基本原理——Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系數(shù)、摩爾吸光系等概念、相互關(guān)系及計(jì)算。熟悉標(biāo)準(zhǔn)曲線法及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法。了解吸收光譜的意義及繪制方法。了解分光光度計(jì)的基本構(gòu)造,提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法。了解可見(jiàn)分光光度法和紫外分光光度法的異同點(diǎn)。

第3頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分光光度法

根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、λυ定量分析的一種方法。第4頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月預(yù)習(xí)問(wèn)題與提綱1．在吸收光譜中，定性分析和定量分析的依據(jù)是什么？2．

Lambert–Beer定律的公式及應(yīng)用？3．可見(jiàn)分光光度法有哪兩種？

4．分光光度法的誤差有哪些？5．如何提高分析的準(zhǔn)確度？

第5頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜*第二節(jié)分光光度法基本原理*第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法*

第四節(jié)提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法*第五節(jié)紫外分光光度法簡(jiǎn)介*本章小結(jié)*參考文獻(xiàn)*第6頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜

一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。第7頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二．物質(zhì)的吸收光譜（A-λ圖）以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，可得一曲線，即為吸收光譜(absorptionspectrum)或稱吸收曲線(absorptioncurve),右圖為不同濃度時(shí)三(鄰二氮菲)合鐵(II)配離子的吸收光譜。第8頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜特點(diǎn):①具有最大吸收波長(zhǎng)。②不同物質(zhì),λmax不同，λmax

是定性分析的依據(jù)。③λmax幾乎不隨物質(zhì)的濃度而變。第9頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜④λmax附近，A最大，并與濃度c

呈正比關(guān)系----定量分析依據(jù)。⑤遠(yuǎn)離λmax的光,物質(zhì)幾乎不吸收光（A→0）,這些光的A與物質(zhì)的c無(wú)直接關(guān)系----不作定量分析依據(jù)。注意：物質(zhì)對(duì)光的吸收越多，呈顏色越深，溶液濃度越濃。第10頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理

一、透光率和吸光度入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It透光率T=It/I0第11頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理I0溶劑

I0,

I0溶液

It∴T=It/I0

透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，用符號(hào)A表示。

A愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。吸光度A=-lgT=lgI0/It第12頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理二

Lambert―Beer定律當(dāng)I0一定時(shí)，A只與液層厚度（b）和溶液濃度C有關(guān)：①Io，c一定，A∝b

②Io，b一定,A∝c∴A=abc注意：Beer定律僅適用于單色光。第13頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

物質(zhì)的吸收光譜

單位：

b----cm。

a為吸光系數(shù)：Lg-1cm-1,c單位:g/L。

ε為摩爾吸光系數(shù)：L·mol-1·cm-1，c單位：mol/L，

a與ε的關(guān)系:ε=aM

M表示被測(cè)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。第14頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法

基本原理由Lambert―beer定律

可知吸光度與溶液濃度之間為正比關(guān)系，而透光率與溶液濃度之間為指數(shù)函數(shù)關(guān)系：-lgT=

bc

T=10-bc第15頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法基本原理例：已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇配成濃度為0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長(zhǎng)處用2.00cm吸收池測(cè)得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)及質(zhì)量吸光系數(shù)a。解：第16頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

分光光度法基本原理例：測(cè)試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光度如下A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，試計(jì)算每一組分的濃度。已知：酶的(280nm)=2.96104Lmol-1cm-1(260nm)=1.52104Lmol-1cm-1

AMP的(280nm)=2.4103Lmol-1cm-1(260nm)=1.5104Lmol-1cm-1吸收池厚度為1.00cm。第17頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法

一分光光度計(jì)分光光度計(jì)儀器型號(hào)很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框圖示意如下光源→單色光器→吸收池→檢測(cè)器→訊號(hào)處理及顯示器第18頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法二、測(cè)定方法

可見(jiàn)分光光度法常用于定量測(cè)定，根據(jù)Lambert-Beer定律，在一定波長(zhǎng)條件下，吸光度與濃度成正比，因此在分光光度計(jì)上測(cè)出吸光度，通過(guò)下列方法即可求出被測(cè)物質(zhì)含量:第19頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法在測(cè)定溶液吸光度時(shí)，為了消除溶劑或其它物質(zhì)對(duì)入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面對(duì)光的反射等與被測(cè)物吸收無(wú)關(guān)的因素的影響，必須采用空白溶液(又稱參比溶液)作對(duì)照。常用的空白溶液有下列三種。①溶劑空白②試劑空白③試樣空白第20頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)可見(jiàn)分光光度法2.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法先配制一個(gè)與被測(cè)溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其濃度用cs表示)，在max處測(cè)出吸光度As，在相同條件下測(cè)出試樣溶液的吸光度Ax，則試樣溶液濃度cs可按下式求得：cx=csAx/As第21頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)

提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差分光光度法的誤差主要來(lái)自以下幾方面：1.溶液偏離Beer定律引起的誤差測(cè)定條件：均勻穩(wěn)定的稀溶液，單色光。2.儀器誤差，A為0.2～0.7,誤差較小。3.主觀誤差。第22頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)

提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法二選擇合適的顯色劑條件：

1.靈敏度

2.選擇性高

3.生成的有色物質(zhì)有確定的組成

4.生成的有色物質(zhì)要穩(wěn)定

5.顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收。第23頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)

提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法三、選擇合適的測(cè)定條件

1.波長(zhǎng)的選擇（入max）；

2.顯色劑的用量要適量；

3.酸度（A–pH曲線）；

4.顯色時(shí)間（A–t曲線）；

5.溶液濃度控制在A=0.2~0.7范圍;

6.掩蔽干擾離子。第24頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第五節(jié)紫外分光光度法簡(jiǎn)介

一、751-G型分光光度計(jì)二、紫外分光光度法的應(yīng)用1.定性鑒別比較max、(max)或a(max)比較吸光度(或吸光系數(shù)的比值)2.定量測(cè)定3.有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)研究第25頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)紫外分光光度法簡(jiǎn)介例已知維生素B12的α(361nm)=20.7Lg-1cm-1。精密稱取樣品30.0mg，加水溶解后稀釋至1000ml，在波長(zhǎng)361nm處用1.00cm吸收池測(cè)得樣品的吸光度為0.618，計(jì)算樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。解

所測(cè)樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量濃度：第26頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種方法。以入射光的波長(zhǎng)()為橫坐標(biāo)，溶液的吸光度(A)為縱坐標(biāo)畫出的曲線，即吸收光譜，吸收光譜中吸光度最大的波長(zhǎng)，為最大吸收波長(zhǎng)，用max表示。第27頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)分光光度法測(cè)定物質(zhì)含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即A=bc，此處c為物質(zhì)的量濃度，稱為摩爾吸光系數(shù)，若用質(zhì)量濃度代替物質(zhì)的量濃度c，則相應(yīng)地改為a，A=ab，a為質(zhì)量吸光系數(shù)，a與及物質(zhì)的摩爾質(zhì)量M之間的關(guān)系為：

=aM吸光度A與透光率T的關(guān)系是：A=-lgT第28頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)可見(jiàn)分光光度計(jì)是以可見(jiàn)光(鎢燈)為光源，而紫外分光光度計(jì)是以氫燈作光源，經(jīng)單色器分光后提供所需的波長(zhǎng)進(jìn)入被測(cè)溶液。定量測(cè)定時(shí)，常用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法、比吸光系數(shù)比較法以及差示分光光度法。它們各有其適用的范圍。第29頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)為了提高測(cè)量的靈敏度和準(zhǔn)確度，必須從以下幾個(gè)方面考慮：

1.

提供測(cè)定時(shí)所需的單色光(一般為max)。

2.溶液的濃度宜小。

3.在A=0.2~0.7的范圍內(nèi)測(cè)量。

4.選擇合適的顯色劑。

5.選擇合適的顯色條件。第30頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章小結(jié)由于許多物質(zhì)在可見(jiàn)光區(qū)無(wú)特征吸收，而在近紫外(200nm~400nm)卻有特征吸收，故需用紫外光為光源進(jìn)行測(cè)定。紫外分光光度法除