蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

實驗二蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)一、 實驗?zāi)康?、 了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接形式。2、 了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3、 學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。二、 呈色反應(yīng)1、雙縮脲反應(yīng)（1）原理：尿素加熱至180oC左右，生成雙縮腿并放出一分子氨。雙縮腿在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮腿反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮腿相似，也能發(fā)生此反應(yīng)（二肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)）?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。反應(yīng)式如下：雙縮腿反應(yīng)不僅為含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有，含有一個肽鍵和一個-cs-nh2,-ch2-nh2,

-CHR-NH,-CH-NH-CH-NH-CH-OH或-CHOHCHNH等基團(tuán)的物質(zhì)以及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應(yīng)。2 2 2 2 2 2 2NH3也干擾此反應(yīng)，因為NH3與CU2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮腿反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。（2）試劑①尿素，②10%氫氧化鈉溶液，③1%硫酸銅溶液，④2%卵清蛋白溶液（改為蛋清溶液:水=1：9）（3）操作取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮腿。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1mL，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。（由于雜質(zhì)以及氨氣的干擾，導(dǎo)致顏色不都是紫紅色）向另一試管加2%卵清蛋白溶液（改為蛋清溶液：水=1：9）約1mL和10%氫氧化鈉溶液約2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。2、茚三酮反應(yīng)（1）原理蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有-氨基酸均能發(fā)生該反應(yīng)，除無a-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色反應(yīng)外，其它均生成藍(lán)紫色化合物，最終生成藍(lán)色化合物。氨、5-丙氨酸和許多一級氨化合物都有此反應(yīng)。尿素、馬尿酸、二酮毗嗪和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反應(yīng)。因此，雖然蛋白物質(zhì)。反應(yīng)機理如下:OOOI

尸、/"/OHHO質(zhì)或氨基酸均有前三酮反應(yīng)，但能與前三酮反應(yīng)呈陽性反應(yīng)的不一定都是蛋白質(zhì)或氨基酸。該反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫羧成醛，放出物質(zhì)。反應(yīng)機理如下:OOOI

尸、/"/OHHOHI+ HJM一C一COOH >2IRO_//NH3 +CO2+R—C、..H還原型茚三酮

O還原型茚三酮HOHNH3 +OOlC".x■-H言NO+O還原型茚三酮HOHNH3 +OOlC".x■-H言NO+3H2O藍(lán)紫色該反應(yīng)非常靈敏，1：150萬濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。但在定性、定量測定中，一方面要嚴(yán)防干擾物存在，另一方面要在適宜的PH條件下進(jìn)行測定。該反應(yīng)的適宜的PH為5?7,同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。試劑①蛋白質(zhì)溶液：2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清:水=1：9)，②0.5%甘氨酸，③0.1%茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。操作取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混勻，在沸水浴中加熱1?2分鐘，觀察顏色由粉色變紫色再變藍(lán)色(pH不同顏色深淺不同)。在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。3、黃色反應(yīng)原理含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醍酸鈉。HO含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醍酸鈉。HO— +HNO3鄰硝醌酸鈉(橙黃色)多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。（2） 試劑雞蛋清溶液（將新鮮雞蛋清用6層紗布過濾，然后按雞蛋清：水=1：20配制而成。大豆提取液：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。③頭發(fā)。④指甲。⑤0.5%苯酚溶液。⑥濃硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪氨酸溶液。⑨10%氫氧化鈉溶液。（3） 操作向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化（1?4管可能需要加熱）。管號1234567材料雞蛋清溶液大豆提取液指甲頭發(fā)0.5%苯酚0.3%色氨酸0.3%酪氨酸濃硝酸4滴4滴少許少許4滴4滴4滴現(xiàn)象1現(xiàn)象24、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)（1）原理考馬斯亮藍(lán)G250（R250）具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色;當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時間達(dá)到平衡，在室溫一小時內(nèi)穩(wěn)定。在0.01?1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。（2） 試劑①蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清：水=1：20配制而成）。②考馬斯亮藍(lán)溶液：考馬斯亮藍(lán)G25000mg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取原液15mL，加蒸餾水至100mL，用粗濾紙