脂質(zhì)體電動(dòng)色譜用于評(píng)價(jià)藥物透皮吸收

史上最快最全的網(wǎng)絡(luò)文檔批量下載批量上傳，盡在：http:〃item.taobao?com/item?htm?id=9176907081史上最快最全的網(wǎng)絡(luò)文檔批量下載批量上傳，盡在：http:〃item.taobao?com/item.htm?id=9176907081脂質(zhì)體電動(dòng)色譜用于評(píng)價(jià)藥物透皮吸收王永軍，劉洪卓，孫進(jìn)，孫英華，劉曉紅，何仲貴※(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院生物藥劑學(xué)研究室，遼寧沈陽，110016)摘要：目的采用脂質(zhì)體電動(dòng)色譜法對(duì)藥物透皮吸收進(jìn)行評(píng)估。方法測(cè)定22個(gè)不同種類化合物的保留因子(化)，采用逐步回歸法在藥物透皮參數(shù)(logKp)和logk及其它簡(jiǎn)單理化參數(shù)之間建立定量保留活性關(guān)系(quantitativeretention-activityrelationships,QRARs)。結(jié)果建立了藥物透皮參數(shù)(logKp)和logk、分子量、化合物OH、NH鍵數(shù)目之和之間的相關(guān)方程，相關(guān)系數(shù)R2=0.902。結(jié)論脂質(zhì)體電動(dòng)色譜在預(yù)測(cè)藥物透皮系數(shù)方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：脂質(zhì)體；電動(dòng)色譜；透皮參數(shù)；逐步回歸PredictingskinpermeabilityusingliposomeelectrokineticchromatogrpphyYongjunWang,HongzhuoLiu,JinSun,YinghuaSun,XiaohongLiu,ZhongguiHeABSTRACT:OBJECTIVEToestimatedrugpenetrationthroughskinusingliposomeelectrokineticchromatography.METHODSTheretentionfactoroftwenty-twostructurediverselycompoundsweredetermined,quantitativeretention-activityrelationshipswereconstructedbetweenskinpermeationcoefficientsandlogkandotherphysicochemicalparametersbystepwiseregressionmethod.RESULTSaquantitativeretention-activityrelationships(QRARs)wasconstructedbetweencompoundskinpermeabilitycoefficient(logKp)andlogk,molecularweight,thecountsofOHandNHofmoleculebystepwiseregressionmethod(R2=0.902).CONCLUSIONSInaword,LEKCisapromisingrapidtooltopredictdrugpenetrationthroughskin.課題獲國(guó)家自然科學(xué)基金No.30400563和遼寧省自然科學(xué)基金No.20052058資助。作者簡(jiǎn)介：王永軍，男，沈陽藥科大學(xué)藥劑系講師，博士。email：i_maple@163.com※通訊作者：何仲貴，男，沈陽藥科大學(xué)藥劑系教授。Tel:(024)23986320，email:hezhonggui@KEYWORDSliposome;electrokineticchromatography;skinpermeationcoefficients;stepwiseregression借助毛細(xì)管電泳儀，把脂質(zhì)體溶液加入到毛細(xì)管中作為運(yùn)行溶液，脂質(zhì)體作為一種假固定相(pseudostationary)，加壓運(yùn)行后，測(cè)試溶質(zhì)依靠其自身的電泳屬性以及分配進(jìn)入脂質(zhì)體程度的不同而分離，稱之為脂質(zhì)體電動(dòng)色譜(liposomeelectrokineticchromatography,LEKC)。LEKC作為一種定量分析技術(shù)，不具有什么特別的優(yōu)勢(shì)，但由于脂質(zhì)體的組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)與生物膜的相似性，脂質(zhì)體作為一種類生物膜，用于研究藥物與生物膜的相互作用時(shí)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)于LEKC的研究報(bào)道主要集中在基礎(chǔ)研究方面，包括脂質(zhì)體在毛細(xì)管電泳中的遷移機(jī)制U-3】，LEKC中藥物與脂質(zhì)體的作用機(jī)制等方面［4-刀，應(yīng)用研究報(bào)道較少［8-9］。當(dāng)前，藥物化學(xué)高速發(fā)展，化合物數(shù)目急劇增加，同時(shí)中藥中蘊(yùn)含數(shù)目龐大的天然化合物，這些都使得適宜體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征的藥物篩選成為新藥開發(fā)的瓶頸，脂質(zhì)體同天然生物膜結(jié)構(gòu)上的相似性與毛細(xì)管電泳的快速高效性相結(jié)合，為突破這一瓶頸提供了強(qiáng)有力的工具。皮膚由表皮、真皮和皮下組織三部分組成，此外還有汗腺、皮脂腺、毛囊等附屬器。表皮由內(nèi)向外可分為五層，即基層、棘層、粒層、透明層和角質(zhì)層，其中表皮中的角質(zhì)層性質(zhì)與其它各層有較大差異，是藥物透皮吸收的主要屏障。角質(zhì)層主要由角蛋白和脂類成分組成，這些脂類成分包括磷脂、鞘磷脂、膽固醇和一些脂肪酸。角質(zhì)層中不存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的活性蛋白，完全是一個(gè)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的屏障。因此，我們有理由認(rèn)為藥物的透皮吸收與其親脂性密切相關(guān)。本文收集了22個(gè)有皮膚滲透系數(shù)(logKp)的化合物，擬在藥物在LEKC上的保留因子和透皮參數(shù)之間建立一種定量保留一活性關(guān)系，用于預(yù)測(cè)未知化合物的透皮吸收，初步考察它們與透皮參數(shù)的相似性。1實(shí)驗(yàn)條件1.1試藥、試劑及儀器試藥：苯、間苯二酚、氫化可的松、酮洛芬、雙氯芬酸等為沈陽藥科大學(xué)藥劑、藥分教研室提供。試劑：蛋黃磷脂(磷脂酰膽堿含量＞97.5%，PC)，購(gòu)自上海東尚實(shí)業(yè)有限公司；大豆磷脂酰絲氨酸(磷脂酰絲氨酸＞91.9%，PS)，氫化磷脂(HPC)，膽固醇(Chol)，購(gòu)自北京百威昂醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司； Polybrene(PB)、dextransulfate(DS)(MWav=500000)、壬基苯酮，購(gòu)自Aldrich-Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購(gòu)自，二甲基亞颯(DMSO)、甲醇等均為分析純?cè)噭?。儀器：JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；LS230型激光衍射粒徑分析儀(貝克曼一庫(kù)爾特公司)；HPCE-10毛細(xì)管電泳儀(大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司)。1.2電泳條件熔融石英毛細(xì)管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)，總長(zhǎng)43cm，進(jìn)樣端距檢測(cè)窗38cm，內(nèi)徑50pm；溫度：室溫；電壓：+10?20kV；檢測(cè)波長(zhǎng)210nmo全新熔融石英毛細(xì)管的預(yù)處理：1MNaOH溶液沖洗30min；0.1MNaOH溶液沖洗10min；重蒸水沖洗20min。涂層毛細(xì)管的制備：將全新熔融石英毛細(xì)管預(yù)處理后，以5%PB溶液沖洗15min，靜置10min；以3%DS溶液沖洗15min，靜置30min，重蒸水沖洗10min備用。1.3脂質(zhì)體的制備稱取適量磷脂至250mL圓底燒瓶中，加入氯仿一甲醇(9:1，V/V)10mL溶解；60^水浴減壓蒸餾30min除去有機(jī)溶劑；將預(yù)熱至60°C的20mM的pH5.5磷酸鹽緩沖溶液加入燒瓶中，水化分散；探頭超聲20min，參數(shù)設(shè)置為超聲3s，間歇2s,功率200W；然后經(jīng)0.22-urn微孔濾膜過濾，充氮?dú)?。。條件下冷藏備用。1.4溶質(zhì)在LEKC上保留因子的計(jì)算usk= (Eq.(1)(te()(1-「))lipk=(。一頊 Eq.(2)t(t(1-廣))lip公式1、2分別為中性和荷電溶質(zhì)保留因子的計(jì)算公式，tr、yt如分別為溶質(zhì)在LEKC上的出峰時(shí)間、電滲流出峰時(shí)間(甲醇、二甲基亞颯等標(biāo)記)、脂質(zhì)體出峰時(shí)間(壬基苯酮等標(biāo)記)，t0為帶電溶質(zhì)在CZE下的運(yùn)行時(shí)間。2結(jié)果與討論2.1定量保留-活性關(guān)系的建立為建立一種定量保留一活性關(guān)系，用于預(yù)測(cè)未知化合物的透皮吸收，收集了22個(gè)有皮膚滲透系數(shù)(logKp)的化合物，分別采用含有膽固醇脂質(zhì)體和不含有膽固醇脂質(zhì)體測(cè)定其LEKC保留因子，結(jié)果見表1。表1Tab.1對(duì)logkChol或logk與logKp之間進(jìn)行相關(guān)性研究，沒有發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的相關(guān)性。Lien等人曾報(bào)道如下的logKp預(yù)測(cè)模型，見Eq.(4-2)[⑶。logKp=kJogP+k2MW+k3Hb+k4 Eq.(3)logP為正辛醇/水分配系數(shù)，MW為分子量，Hb指代的是化合物氫鍵的數(shù)目，k「k2、k3為回歸系數(shù)，k4為回歸常數(shù)。為建立化合物L(fēng)EKC保留因子與logKp之間的預(yù)測(cè)模型，我們引入了MW/100、OsNs、OHsNHs、PSA等理化參數(shù)，以逐步回歸方法剔除不顯著的參數(shù)，最后引入的參數(shù)中只保留了MW/100和OHsNHs，回歸結(jié)果見下：

0.20(0.18)0.10(0.19)0.37(0.31)logKp=0.42(0.13)logkChol-0.92(0.09)看-0.37(0.08)OHsNHs+0.20(0.18)0.10(0.19)0.37(0.31)Eq.(4)R2=0.935,SE=0.379,n=22MW]"p=0.44(0」7岫-0.89。10)100-0.40(0.09)朋用+Eq.(5)R2=0.923,SE=0.410,n=22為與正辛醇/水系統(tǒng)作以比較，同樣進(jìn)行回歸處理，結(jié)果如下：、 ……MW 岫=0.19(0E"-爵7"而-0.26(0.13)OHsNHs-Eq.(6)R2=0.911,SE=0.441,n=22從上述等式看，以含有膽固醇脂質(zhì)體的LEKC建立了最好的相關(guān)模型，即Eq.⑷，因?yàn)镋q.⑷有著最高的相關(guān)系數(shù)(R2=0.935)和最小的均方根誤差(SE=0.379)；而以正辛醇/水系統(tǒng)建立的模型相對(duì)較差，因?yàn)镋q.(6)有著最大的均方根誤差(SE=0.441)和最低的相關(guān)系數(shù)(R2=0.911)。從等式的系數(shù)看，log*、logP與logKp正相關(guān)，而MW/100、OHsNHs與logKp負(fù)相關(guān)。因?yàn)閘og*、log尸是化合物的親脂性參數(shù)，這也正說明了化合物的親脂性增加更有利于其滲透進(jìn)入皮膚，而親水性的化合物則不易滲透進(jìn)入；MW/100代表的是分子體積，描述的是分子體積對(duì)其從水相分配進(jìn)入生物膜及通過生物膜擴(kuò)散的影響；OHsNHs指代的是化合物分子的氫鍵供體數(shù)目，與logKp的負(fù)相關(guān)說明化合物分子氫鍵供體數(shù)目增加不利于其滲透進(jìn)入皮膚。2.2模型驗(yàn)證由于所收集的化合物數(shù)目較少，只有22個(gè)，不足以分為測(cè)試集和驗(yàn)證集對(duì)相關(guān)模型進(jìn)行驗(yàn)證，所以我們采用了leave-one-out的方法進(jìn)行模型驗(yàn)證。所謂leave-one-out模型驗(yàn)證就是在總的數(shù)據(jù)(n)中去掉一個(gè)數(shù)據(jù)，用余下的數(shù)據(jù)(n-1)建立模型來預(yù)測(cè)去掉的這個(gè)數(shù)據(jù)，如此類推，經(jīng)過n次迭代計(jì)算，即可獲得n個(gè)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，將原試驗(yàn)值與測(cè)試值進(jìn)行相關(guān)比較來考察所建立模型的預(yù)測(cè)能力。采用該方法分別對(duì)Eq.(4)、Eq.(5)、Eq.(6)進(jìn)行模型驗(yàn)證，各預(yù)測(cè)值見表2,相關(guān)散點(diǎn)圖見圖1、2、3。表2Tab.2圖1Fig!圖2Figi圖3Figi從圖1、2、3可看出，基于LEKC建立的Eq.(4)預(yù)測(cè)的logKp值與試驗(yàn)值有最好的相關(guān)性(R2=0.934)，而基于正辛醇/水系統(tǒng)建立的Eq.⑹的預(yù)測(cè)能力相對(duì)較差(R2=0.911)。這是由于脂質(zhì)體與正辛醇/水系統(tǒng)的本質(zhì)差別造成的，log尸描述的僅是化合物分子形態(tài)在兩相中的分配，而化合物的解離狀態(tài)強(qiáng)烈影響其在皮膚中的滲透性。2.3與文獻(xiàn)模型的比較把文獻(xiàn)報(bào)道的皮膚滲透模型與我們建立的模型加以比較，總結(jié)見表3。Flnn等［14］最先報(bào)道了logKp與log尸之間的相關(guān)性，R2=0.26，所測(cè)試的化合物有90種，分子量從18?750，log尸從-3?6；Potts等［14］在Flnn研究的基礎(chǔ)上，引入了分子量，并減少了化合物數(shù)量至42種，R2=0.82；Lien等［15］又在Potts的基礎(chǔ)上引入氫鍵項(xiàng)Hb，進(jìn)一步減少測(cè)試化合物至23種，R2=0.93；Barbato等［16］用IAM考察了10種藥物的親脂性，經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)除疏水作用力外其它作用力強(qiáng)度的總和(AIq^am)與logKp呈負(fù)相關(guān)，R2=0.91；Medina-Hernandez等［17］用BMC測(cè)定化合物親脂性，在引入熔點(diǎn)項(xiàng)的基礎(chǔ)上，測(cè)試了43種化合物，R2=0.79。各個(gè)預(yù)測(cè)模型所測(cè)試的化合物數(shù)目種類不一樣，無法進(jìn)行直接比較。但從相關(guān)系數(shù)看，我們所建立的模型給出了最好的結(jié)果，并且所測(cè)試的化合物性質(zhì)、結(jié)構(gòu)更多樣，更具代表性，另外LEKC技術(shù)的高通量篩選優(yōu)勢(shì)也是上述模型所無法比擬的。表3Tab.33結(jié)論測(cè)定了22個(gè)化合物pH5.5條件下的LEKC保留因子，采用逐步回歸的方法，引入其它理化參數(shù)，建立了藥物透皮參數(shù)logKp與log*、MW/100、OHsNHs之間的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明含有膽固醇脂質(zhì)體所建立的模型比沒有膽固醇脂質(zhì)體所建立的模型，相關(guān)系數(shù)更高、方程均方根誤差更低。采用leave-one-out方法對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果也表明了較之正辛醇/水系統(tǒng)，脂質(zhì)體在本質(zhì)上更為接近于生物膜。與文獻(xiàn)報(bào)道的其它預(yù)測(cè)模型相比較，本研究所測(cè)試的化合物性質(zhì)、結(jié)構(gòu)更多樣，模型更具代表性，LEKC技術(shù)也更具高通量篩選優(yōu)勢(shì)。參考文獻(xiàn)WiedmerSK,HolopainenJM,MustakangasP,etal,Liposomeascarriersinelectrokineticcapillarychromatography[J],Electrophoresis,2000,21:3191-3198WiedmerSK,HautalaJ,HolopainenJM,etal,Studyonliposomesbycapillaryelectrophoresis[J],Electrophoresis,2001,22:1305-1313WiedmerSK,JussilaM,HolopainenJM,etal,Cholesterol-containingphosphatidylcholineliposomes:characterizationanduseasdispersedphaseinelectrokineticcapillarychromatography[J],JSepSci,2002,25:427-437BurnsST,KhalediMG,Rapiddeterminationofliposome-waterpartitioncoefficientusingliposomeelectrokineticchromatography[J],JPharmSci,2002,91:1601-1612BurnsST,AgbodjanAA,KhalediMG,Characterizationofsalvationpropertiesoflipidbilayermembranesinliposomeelectrokineticchromatography[J],JChromatogrA,2002,973:167-176CarrozzinoJM,KhalediMG,Interactionofbasicdrugswithlipidbilayersusingliposomeelectrokineticchromatography[J],PharmRes,2004,21:2327-2335CarrozzinoJM,KhalediMG,pHeffectsondruginteractionswithlipidbilayersbyliposomeelectrokineticchromatography[J],JChromatogrA,2005,1079:307-316OrnskovE,GottfriesJ,EricksonM,etal,Experimentalmodelingofdrugmembranepermeabilitybycapillaryelectrophoresisusingliposomes,micellesandmicroemulsions[J],JPharmPharma,2005,57:435-442PascoeRJ,MasucciJA,FoleyJP,Investigationofvesicleelectrokineticchromatographyasaninvitroassayfortheestimationofintestinalpermeabilityofpharmaceuticaldrugcandidates[J],Electrophoresis,2006,27:793-804Burns,S.T.,Khaledi,M.G.,Rapiddeterminationofliposomewaterpartition...usingliposomeelectrokineticchromatography[J],J.Pharm.Sci.2002,91,1601-1612ViethM,SiegelMG,HiggsRE,etal,Characteristicphysicalpropertiesandstructuralfragmentsofmarketedoraldrugs[J],JMedChem,2004,47:224-232NeumannD,KohlbacherO,MerkwirthC,etal,Afullycomputationalmodelforpredictingpercutaneousdrugabsorption[J],JChemInfModel,2006,46:424-429LienEJ,GaoH,QSARanalysisofskinpermeabilityofvariousdrugsinmanascomparedtoinvivoandinvitrostudiesinRodents[J],PharmRes,1995,12:583-587FlynnGL,Physicochemicaldeterminantsofskinabsorption,InPrinciplesofRoute-to-RouteExtrapolationforRiskAssessment[M],EditedbyGarrityTRandHenryCJ,Elsevier:NewYork,1990:93-127RenS,DasA,LienEJ,QSARanalysisofmembranepermeabilityotorganiccompounds[J],JDrugTarget,1996,4:103-107BarbatoF,CappelloB,MiroA,etal,Chromatographicindexesonimmobilizedartificialmembranesforthepredictionoftransdermaltransportofdrugs[J],Farmaco,1998,53:655-661Martinez-PlaJJ,Martin-BioscaY,SagradoS,etal,Biopartitioningmicellarchromatographytopredictskinpermeability[J],BiomedChrom,2003,17:530-537

表1滲透系數(shù)的試驗(yàn)值以及各種試驗(yàn)和計(jì)算的理化參數(shù)Table.1Experimentalpermeabilitycoefficientsandexperimentalandcalculated

physicochemicalparameters.CompoundsExperimentallog^Chola)logkb)MW/100c)OHsNHsd)logKp(cm/h)[12]logPAmobarbital-2.642.11-0.69-0.642.262.00Aniline-1.660.84-1.37-1.040.932.00Phenol-1.901.46-1.16-0.640.941.00Anisole-1.602.11-0.35-0.111.080.00Benzylalcohol-1.771.10-1.27-0.451.081.00Ibuprofen-1.443.660.00Indomethacin-3.673.08-1.05-0.993.580.00Ranitidine-4.050.63-1.13-0.763.143.00Hydrocortisone-4.721.43-0.36-0.124.332.00Famotidine-4.79-0.575.00Chlorphenamine-2.665.800.620.622.751.004-Chlorophenol-1.482.40-0.49-0.201.291.004-Bromophenol-1.442.531.004-Methylphenol-1.821.97-0.50-0.101.081.00Ethylbenzene0.083.170.620.601.060.00Toluene0.002.64-0.02-0.020.920.00Benzaidehyde-0.851.48-0.88-0.791.060.002-Naphthol-1.552.840.800.801.441.00Phenobarbital-3.351.24-0.83-0.542.262.00Ephedrine-2.220.89-0.72-0.331.652.00Piroxicam-3.810.80-1.10-0.723.312.00Benzene-0.962.14-0.16-0.160.780.00Chromatographicconditions:9mMPC80PS20-6mMcholesterolliposomesin10mMpH5.5phosphatebuffer,appliedvoltage,+20kVChromatographicconditions:9mMPC80PS20liposomesin10mMpH5.5phosphatebuffer,appliedvoltage,+20kV.Molecularweightwasdividedby100toscaleitwithLEKCretentionfactors.OHsNHs,thecountsofOHsandNHs,approximatelyrepresentinghydrogen-bonddonord11】.表2采用Eq.(4)、Eq.(5)、Eq.(6)計(jì)算的預(yù)測(cè)值及試驗(yàn)值Table.2ExperimentalandpredictedpermeabilitycoefficientsdeterminedusingEq.(4),(5)and(6).CompoundsExperimentallog阡(cm/h)PredictedlogKpEq.⑷Predictedlog阡Eq.⑸PredictedlogKpEq.(6)Amobarbital-2.64-2.08-2.09-1.75Aniline-1.66-1.08-1.00-0.65Phenol-1.90-0.67-0.50-0.31Anisole-1.60-0.10-0.01-0.06Benzylalcohol-1.77-0.84-0.56-0.51Ibuprofen-1.44-0.80-0.76-0.73Indomethacin-3.67-2.56-2.47-2.20Ranitidine-4.05-3.40-3.28-3.10Hydrocortisone-4.72-3.76-3.61-3.77Famotidine-4.79-3.69-3.74-3.12Chlorphenamine-2.66-1.56-1.52-1.074-Chlorophenol-1.48-0.74-0.65-0.504-Bromophenol-1.44-0.86-0.87-0.904-Methylphenol-1.82-0.55-0.41-0.37Ethylbenzene0.080.360.360.18Toluene0.008Benzaidehyde-0.85-0.29-0.26-0.102-Naphthol-1.55-0.28-0.27-0.26Phenobarbital-3.35-2.14-2.05-1.71Ephedrine-2.22-1.53-1.41-1.37Piroxicam-3.81-3.18-3.03-2.96Benzene-0.960.260.240.34