酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文題目名稱：酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化學(xué)生姓名：王發(fā)明 院系：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級:07級生物技術(shù)指導(dǎo)教師：三莘 職稱：教授2011年5月17日TOC\o"1-5"\h\z題目 I摘要及鍵詞 I1前言 12實驗材料和方法 12.1實驗材料和儀器 12.1.1實驗材料及試劑 12.1.2實驗儀器 12.2實驗方法 12.2.1豬皮的簡單預(yù)處理 12.2.2膠原蛋白的提取和純化 12.3蛋白質(zhì)含量測定 12.3.1考馬斯亮藍法 標準曲線的制作 樣品蛋白的測定 蛋白質(zhì)含量計算 23結(jié)果與分析 2\o"CurrentDocument"3.1酶處理條件對膠原蛋白提取量的影響 2\o"CurrentDocument"3.1.1酶處理pH值對膠原蛋白提取量的影響 2\o"CurrentDocument"3.1.2酶處理時間對膠原蛋白提取量的影響 3\o"CurrentDocument"3.1.3酶處理溫度對膠原蛋白提取量的影響 33.1.4加酶量對膠原蛋白提取量的影響 44討論 45結(jié)論 5參考文獻 5致謝 6酶法提取豬皮中膠原蛋白的工藝優(yōu)化姓 名：王發(fā)明專 業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師：王莘摘要：目的：對豬皮中進行膠原蛋白提取。方法：用中性蛋白酶預(yù)處理豬皮，再用考馬斯亮藍法測得膠原蛋白的含量。結(jié)果：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過對比實驗確定膠原蛋白提取的最佳條件：酶處理pH6,加酶量(E/S)400U/g，溫度40°C,處理時間2h。關(guān)鍵詞：膠原蛋白；酶處理；考馬斯亮藍Semi-bionicextractionofpigskintooptimizethetechnologyof

collagenName:WangFamingMajor:BiotechnologyTutor:WangXinAbstract：purpose:Thepigskinextractionofcollagen.Methods:useneutralproteasepretreatmentpigskin,reoccupytestmeasuredMaSiLiangbluemethodofcollagencontent.Results:onthebasisofsinglefactorexperiment,throughthecontrastexperimentdeterminedthebestconditionofcollagenextractionenzymetreatmentpH6,add,enzymequantity(E/S)400U/g,temperature40°C,theprocessingtime2h.Keywords:Collagen;Enzymetreatment;CoomassieBrilliantBlue1前言豬皮中的蛋白質(zhì)含量高達33%,其中膠原蛋白含量為87.8%［1］，而瘦豬肉的蛋白含量僅為18%左右。由此看來豬皮中的蛋白質(zhì)含量遠高于瘦豬肉，其營養(yǎng)價值十分可觀。此外膠原蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)與功能，并具有皮膚保濕等的用途，開發(fā)膠原蛋白產(chǎn)品已經(jīng)成為人們研究的熱點［樵隨著生物和高分子科學(xué)的不斷發(fā)展，人們會對此有更深的了解和認識，因此開發(fā)膠原蛋白資源具有廣闊的前景。本論文實驗研究主要利用中性蛋白酶處理豬皮，采用考馬斯亮藍方法測定豬皮中的膠原蛋白含量的方法。通過酶的不同處理條件，膠原蛋白提取量的比較來確定膠原蛋白提取的最佳條件，是對膠原蛋白的提取進行的基礎(chǔ)性研究工作。2材料和方法2.1實驗材料和儀器2.1.1實驗材料及試劑豬皮，中性蛋白酶，牛血清蛋白，無水乙醇，NaCl溶液，蒸餾水，考馬斯亮藍溶液2.1.2實驗儀器電動攪拌器，電子天平，恒溫水浴鍋，離心機，分光光度計2.2實驗方法2.2.1豬皮的簡單預(yù)處理⑶將皮下脂肪剔除，切成10mmx10mm的小塊，用35C的清水洗2次，再用無水乙醇浸泡，振蕩約10小時，棄掉有機溶劑。2.2.2膠原蛋白提取和純化稱取一定量經(jīng)簡單預(yù)處理的皮塊于燒杯中，加入相應(yīng)量的中性蛋白酶，并用緩沖溶液控制pH值，在一定溫度下攪拌一定時間，離心去殘渣⑷，上清液經(jīng)考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)提取量⑸。2.3蛋白質(zhì)含量的測定2.3.1考馬斯亮藍法標準曲線的制作⑹稱取10mg牛血清蛋白用蒸餾水定容至100ml（100ug/ml）分別取0ml,0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml,0.6ml,0.7ml,0.8ml，用蒸餾水補足1ml,再分別加入5ml考馬斯亮藍G-250,搖勻。放置2min后在595nm波長下比色測定（比色應(yīng)在1h內(nèi)完成測定）。以牛血清蛋白含量（ug）為縱坐標，以吸光度為橫坐標。如圖3-1圖2-1標準曲線Figure2-1standardcurve樣品蛋白的測定取1試管準確加入0.1ml蛋白溶液，再加入0.9ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2min后，以標準曲線1號試管做參比，在595nm波長下比色，記錄吸光度蛋白質(zhì)含量計算樣品蛋白質(zhì)含量（ug/g）=CVT/WVS試中C——查標準曲線值VT——提取液總體積W——豬皮鮮重VS——測定時加樣量3結(jié)果與分析3.1酶處理條件對膠原蛋白提取量的影響3.1.1酶處理pH值對膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡單預(yù)處理的豬皮,在不同pH體系下進行酶處理，酶處理溫度35C、酶處理時間2h、加酶量400U/g。之后進行考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖3-1所示。Figure3-1EnzymestoextractproteinwhenprocessingtheamountofthepHinfluence從圖3-1可以看出，蛋白的提取量在pH6到6.5的區(qū)間內(nèi)不斷升高，pH6.5時達到最大值，而PH6.5到7.5之間逐漸下降，之后逐漸趨于平穩(wěn)，說明pH6.5是該酶的最適PH。3.1.2酶處理時間對膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡單預(yù)處理的豬皮，用酶處理不同的時間，酶處理溫度35C、pH6.5加酶量400U/g。之后進行考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖3-2所示。圖3-2酶處理時間對蛋白量的影響Figure3-2Enzymestoproteinprocessingtimetheamountofinfluence從圖3-2可以看出，蛋白提取量在酶處理時間1小時到2小時逐漸升高，在2小時時達到最大值，之后又隨著酶處理時間增加而降低，說明該酶的最適處理時間為2小時。3.1.3酶處理溫度對提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡單預(yù)處理的豬皮，在不同溫度下進行酶處理，酶處理時間2h、pH6.5、加酶量400U/g。之后進行考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖3-3所示。處理溫度幻圖3-3酶處理溫度對蛋白量的影響Figure3-3Enzymetreatmenteffectoftemperatureonproteinquantity從圖3-3可以看出蛋白的提取量隨著酶處理溫度的升高而逐漸升高在40C的時候達到最大追，之后又隨著溫度升高而降低，說明該酶的最適溫度為40C。3.1.4加酶量對膠原蛋白提取量的影響稱取一定量經(jīng)簡單預(yù)處理的豬皮，采用不同的加酶量對豬皮進行酶處理，酶處理溫度35C、pH6.5、時間2h。之后進行考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖3-4所示。加u/g)200400600加u/g)200400600800圖3-4加酶量對蛋白量的影響Figure3-4Addenzymeamountofproteinamountofinfluence從圖3-4可以看出，蛋白提取量隨著加酶量的增加而組建升高在400U/g時達到最大值，之后隨著加酶量增加而組建降低，說明加酶量在400U/g時蛋白提取量最大。4討論4.1膠原蛋白的提取量在pH值6.5時最大。而在兩邊區(qū)域，蛋白量均有所降低。這說明對于中性蛋白酶而言，在pH偏酸性時，對豬皮的處理效果最好。4.2膠原蛋白的提取量在酶處理時間為2h時出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，蛋白質(zhì)的量均有所降低，酶處理時間過短，不能充分疏松豬皮表層結(jié)構(gòu)、除去非纖維蛋白中的球狀蛋白、軟化膠原蛋白的皮層，酶處理時間過長，豬皮中部分膠原蛋白可能溶于緩沖溶液中，導(dǎo)致豬皮中膠原蛋白溶失，膠原蛋白提取量低，因此酶處理時間過長或過短，都會影響膠原蛋白的提取量。4.3膠原蛋白的提取量在酶處理溫度40°C時出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。說明中性蛋白酶在40C時酶處理效果最好，過高或者過低的溫度都可能導(dǎo)致酶活性的降低，甚至失活，從而影響酶處理的效果。4.4膠原蛋白的提取量在加酶量400U/g時出現(xiàn)最高值。而在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。這是由于中性蛋白酶作為一種生物催化劑，對底物的吸附作用有一定的飽和度，隨著加酶量的增加，與底物的結(jié)合是逐漸飽和，因此提取率逐漸增加；然而，當(dāng)酶用量增大到飽和值后，豬皮中一部分膠原蛋白由于受酶作用而被緩沖溶液溶解，所以導(dǎo)致提取率略有下降。5結(jié)論采用中性酶法預(yù)處理再用考馬斯亮藍法測定豬皮中膠原蛋白的最佳工藝條件是酶處理pH6.0、處理溫度40°C、加酶量(E/S)400U/g、處理時間2h。參考文獻李開雄，趙志遠，劉霞.豬皮中膠原蛋白的提取及其應(yīng)用[J].肉類研究，1996(4):43481LeeChiH,SinglaAnuj,LeeYugyung.Biomedica.applicationsofCollagen[J].Inter2nationalJournalofPharmaceutics,2001,221:1-221齊玉堂.低脂膠原蛋白制取工藝的研究[J].肉類工業(yè)，2004(5):28301胡勝,李志強，陳敏.豬皮殘存As11398酶活力的酸性抑制[J].中國皮革，2001,30(21):13151蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001食品衛(wèi)生檢驗法(理化部分)[S].北京：中國標準出版社,1986杜敏，南慶賢.豬皮中膠原蛋白的制備及在食品中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，1994(7):37391張毅，向釗，朱丹等榮昌豬繁殖性狀的研究[J]，中國畜牧雜志2004,40(5):52一55張全生，肖國生.榮昌豬的歷史、現(xiàn)狀及發(fā)展對策陰，畜牧獸醫(yī)雜志，2005(5):72一73郭宗義，范首君.榮昌豬保種利用存在的問題與對策[J],豬業(yè)科學(xué)2006,(6):78一80宋凡，曾代勤，王金勇.榮昌豬的保存和利用閉，