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文檔簡介

PCRDNAPCR要設計引物首先要找到DNA增的片段單鏈是否形成二級構造。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級構造，那就可以在這一區(qū)域設計引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設計一對引物。一般引物長度為15~30100~600讓我們先看看P1G+C40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P14個連續(xù)堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進展必要的修飾，例如可以在引5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這3′端確定不能進展任何修飾，由于33′端不要終止33特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR①引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級構造。15~30④G+C40%~60%之間。⑤堿基要隨機分布。445′端可以修飾。3′端不行修飾。33PCR效地擴增模板DNAPCRPCR引物的特異性708基同源。避開產(chǎn)物的二級構造區(qū)某些引物無效的主要緣由是引物重復區(qū)DNAmRNA自由能〔△G°〕58.6lkJ/mol7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP成功是有幫助的。長度度會超過TaqDNA〔74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。G+CG+C40%~60%。其Tm鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm5~10℃。假設按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估量引物的TmTm55~80℃，其Tm72℃以使復性條件最正確。堿根底隨機分布33GCG+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物自身性結合。假設用人工推斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。引物之間3′端的互補重疊以防引物二43′端33′端也不能有形成任何二級構造可能，除在特別的PCR〔AS-PCR〕反響中，引物3′端不能發(fā)生錯配。在標準PCR2UTaqDNA800μmol/LdNTP〔四種dNTP200μmol/L〕以質(zhì)?！?03〕為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1minHIV-1gag3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有確定規(guī)律的。A∶A1/20，A∶GC∶C1/100。引物A：模板GG：模板APCR5′端5′端限定著PCR5′端修飾包括：Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結合DN

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