從細胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新課件

心血管藥理講座從細胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新靶點及干預策略主要介紹內(nèi)容一、研究慢性心衰治療新策略的必要性二、改善心肌能量代謝-治療心衰的關(guān)鍵三、新策略及靶點：細胞因子、能量代謝與心力衰竭四、TNF-α及其受體—心衰的治療靶點及希望？五、抑制TNF-α與TNF-R1的結(jié)合活性的合成的優(yōu)選多肽Pep3治療心衰效果評價六、進一步研究思路2精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”世界衛(wèi)生組織08年10月發(fā)布了全球疾病狀況的最新評估報告，心血管疾病是當前導致人類死亡的最主要原因。一、研究慢性心衰治療新策略的必要性心血管疾病腫瘤傳染病(29%)心血管疾病的主要死亡原因—心力衰竭發(fā)病率高：國內(nèi)患病率0.8%～0.9%，患者約1200萬,而且每年呈現(xiàn)50萬遞增的趨勢；預后差：每年死亡>20萬，五年死亡率>50％；費用大：在歐美，治療費用占整個衛(wèi)生支出的2%，是腫瘤的2倍。死亡代償期失代償期惡化期結(jié)構(gòu)和功能的改變---重塑高血壓，冠心病遺傳，心肌病瓣膜病，先心病****心力衰竭心力衰竭的誘因和病理過程6分子機制跨膜信號傳遞胞外刺激基因表達活化細胞形態(tài)、功能改變血流動力學因素神經(jīng)-體液因素CARDIACHYPERTROPHY:TheGood,theBad,andtheUgly.AnnuRevPhysiol,2003.激素、藥物、神經(jīng)遞質(zhì)膜受體第二信使

Ca2+離子通道活性肽心力

衰竭心律失常線粒體活性氧心臟病相關(guān)基因活性肽(1)(1)心力衰竭心力衰竭可能的發(fā)展基礎8FirstStepRef:Webster,MD,PhD:Acne.Dermatol1996,8:237-268慢性心衰治療理念的進步70年代：改善血流動力學紊亂：強心、利尿、擴血管SecondStep90年代：抑制神經(jīng)體液因子：β阻滯劑、ACEI/ARB

ThirdStep21世紀：心肌代謝療法可望成為CHF治療的新靶點。任何減少能量消耗的心力衰竭療法，如β受體阻滯劑，ACEI，ARB均可以改善心衰患者的預后。增加能量消耗的藥物，如正性肌力藥物，則增加心衰的死亡率?！八ソ叩男呐K是一臺缺乏燃料的發(fā)動機”能量缺乏可能是心衰的重要發(fā)病機制NeubauerS.NEnglJMed,2007,356:1140-1151.二、改善心肌能量代謝-治療心衰的關(guān)鍵調(diào)節(jié)心肌能量代謝有望成為治療心衰的新策略

心臟耗能位居所有器官之首，每天消耗6kgATP，搏動約10萬次，向全身泵出10噸血液。心臟通過能量代謝將儲存于脂肪酸或葡萄糖中的化學能轉(zhuǎn)化為機械能，為心臟收縮和舒張?zhí)峁┠芰?。若能量產(chǎn)生和利用的效率發(fā)生改變，心臟便會出現(xiàn)功能障礙。心臟的能量代謝2、糖酵解（極少）1、線粒體氧化代謝脂肪酸（60%-90%）葡萄糖（10%-40%）正常心肌的能量代謝ATP來源正常心肌的能量代謝底物代謝氧化磷酸化能量利用正常心肌的能量代謝過程（一）：底物的利用丙酮酸葡萄糖脂肪酸糖酵解脂酰CoA合成酶乙酰CoA丙酮酸脫氫酶（PDH）有氧狀態(tài)脂酰CoA脂酰CoAβ-氧化三羧酸循環(huán)CO2+NADHMitochondriacytoplasmBlood肉毒脂酰轉(zhuǎn)移酶（CPT）正常心肌的能量代謝過程（二）：氧化磷酸化線粒體內(nèi)膜ⅠⅡⅢⅣQH+H+H+O2H2OH+ⅤATP合酶ADP+PiATPNADH＋HNAD＋FADH2FAD三羧酸循環(huán)游離脂肪酸β氧化Mitochondria主要表現(xiàn)：2004年，VanBilsen等提出心肌代謝重構(gòu)的概念。

VanBilsenM,etal.CardiovascRes,2004,61:218-226心肌代謝重構(gòu)（metabolicremodeling）

由心肌細胞糖類和脂肪等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變，導致細胞結(jié)構(gòu)和功能異常的現(xiàn)象。脂肪酸氧化作用受損，主要的心肌能量來源從脂肪酸β氧化變?yōu)樘墙徒?。重?gòu)過程至失代償狀態(tài)，心肌能量缺乏。

RazeghiP,etal.Circulation,2001,102:2923-2931.

PaolissoG,etal.Metabolism,1994,43:174–179.1心肌底物利用變化衰竭心肌的能量代謝FFA氧化率正?；蛟黾樱咸烟菙z取和糖酵解可能加速，心肌細胞處于代償狀態(tài)。

心衰早期

心衰晚期

脂肪酸氧化受損可能繼發(fā)于線粒體結(jié)構(gòu)紊亂。PDH和CPT-1活性改變脂肪酸氧化的基因表達下調(diào)BilsenMV.CardiovasularRes.2009,81:420-428衰竭心肌的能量代謝1心肌底物利用變化ATP產(chǎn)生減少，心肌收縮、舒張功能障礙2

氧化磷酸化受損線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量改變電子傳遞鏈活性降低ATP合酶效能降低解偶聯(lián)蛋白表達增強IdeT,etal.CircRes,2001,88:529-35.QuigleyAF,etal.JCardFail,2000,6:47-55.CasademontJ,etal.HeartFailRev,2002;7:131-9.衰竭心肌的能量代謝3ATP轉(zhuǎn)移和利用受損線粒體內(nèi)膜ANT蛋白表達下降cytoplasmATPADP+線粒體肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）衰竭心肌的能量代謝PPARα調(diào)節(jié)心肌線粒體功能及脂肪酸氧化的重要核轉(zhuǎn)錄因子。PPARα基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明顯降低，而轉(zhuǎn)基因鼠心肌脂肪酸氧化增強。研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌組織PPARα的表達較正常心肌組織下降54％，PPARα受損可能導致心肌能量匱乏。KarbowskaJ,etal.CellMolBiol

Lett,2003,8:49-53衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)重要的核受體轉(zhuǎn)錄因子--PPARα

外源性配體（調(diào)脂藥）內(nèi)源性配體（長鏈脂肪酸）PPARαPPRE脂肪酸氧化（FAO）基因CD36/FATFABPFACSmCPT-1MCAD,LCADUCP3細胞核PPARα衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)StanleyWC.PhysiolRev.2005,85:1093-1129重要的核轉(zhuǎn)錄共活化因子—PGC-1α衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)可與PPARα等多種核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合PGC-1α生物學效應脂肪酸氧化增強葡萄糖氧化減弱線粒體生物合成增加ZhouSG,LiuPQ*（劉培慶，通訊作者）.ProteomicAnalysisofHypertension-InducedLeftVentricularHypertrophybyTwo-DimensionalDifferenceGelElectrophoresisandMassSpectrometry"JProteomeRes,2006,5(11):2901-2908(IF6.92)24①SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)了18個差異表達蛋白，其中12個是能量代謝密切的酶，如α-烯醇化酶、短鏈脂酰輔酶A脫氫酶、NADH脫氫酶α亞復合體10、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶等研究基礎研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點變化及調(diào)控機制Nmnat2protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT6.Nmnat3protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT3.NAD+的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Nampt）和煙酰胺單核苷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（Nmnat）對NAD+的合成起到了關(guān)鍵的催化作用。NAD+的轉(zhuǎn)運及細胞分布③證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用在心肌肥大中的意義。29②心衰過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PGC-1α、RIP140表達與能量代謝關(guān)鍵指標的關(guān)系30增加線粒體生物合成NRF(核呼吸因子)PGC-1α--PPAR線粒體生物合成。此二者是調(diào)控心肌脂肪酸分解和線粒體供能的樞紐心肌代謝療法—底物的調(diào)節(jié)心肌代謝的爭議與思考脂肪酸葡萄糖心肌肥厚和心衰時，能量代謝底物改變何種程度是代償性的，何種程度是失代償性的？脂肪酸氧化抑制在何時？抑制到什么程度?可以改善心衰。心衰時葡萄糖代謝可以代償脂肪酸氧化降低的能量不足嗎？心衰心肌代謝心衰代謝重構(gòu)在心衰治療中的意義

拮抗神經(jīng)體液：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β-受體阻滯劑心衰缺能－底物的調(diào)節(jié)：

1）增加葡萄糖氧化：曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ)

2）抑制脂肪酸氧化：L-卡尼丁(L-carnitine)3）增強呼吸鏈功能：輔酶Q10

4）補充磷酸肌酸

5）Potentialtherapy:promotemitochondriabiogenesis三.新策略及靶點

細胞因子受體、能量代謝調(diào)控？心衰過程中增高的細胞因子、神經(jīng)激素及生長因子形成網(wǎng)絡，其錯綜復雜的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)紊亂決定了心衰病理過程的復雜性，針對某一靶點或單一環(huán)節(jié)的藥物往往難以起到理想的治療心衰效果。靶向細胞因子受體及心肌能量代謝關(guān)鍵環(huán)節(jié)的藥物具有重要的研發(fā)前景，心衰新靶點的干預正在成為治療心衰的希望。34ArdehaliH,etal..EurJHeartFail.2012;14(2):120-9.經(jīng)典的神經(jīng)-體液因素

腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)交感神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮素系統(tǒng)

胰島素抵抗細胞因子和生長因子

血管平滑肌細胞成纖維細胞血管內(nèi)皮細胞心肌細胞免疫細胞肥大凋亡舒縮增殖膠原的合成和分泌合成細胞因子調(diào)控心肌細胞血管生成炎癥反應調(diào)節(jié)心臟微循環(huán)炎癥反應細胞因子網(wǎng)絡與炎癥反應通路引自:SunSC.ThenoncanonicalNF-κBpathway.ImmunolRev.2012,246(1):125-4037TNF-α及其受體—炎癥性疾病重要治療靶點！TNF-α是諸多炎性相關(guān)疾病細胞因子網(wǎng)絡的關(guān)鍵部分，也是與能量代謝障礙密切相關(guān)的細胞因子，TNF-α主要通過TNFR1介導胞內(nèi)信息傳遞及細胞功能改變，是炎癥性疾病重要治療靶點。38ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002，296:1634

以TNF-α孵育AC16（人源性心肌細胞株）或H9c2細胞（心肌細胞株），可以明顯下調(diào)丙酮酸脫氫酶激酶4、PGC-1α、肉堿脂?；D(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ)，誘導葡萄糖氧化率顯著增加，同時增加MCP-1及IL-6表達增加，該作用主要通過NFκB及P38信號通路。心臟特異性過表達TNF-α小鼠(Musmusculus)也表現(xiàn)出明顯的PGC-1α表達下調(diào)。GaoF,etal.JCardiovascPharmacol.2012;59(6):500-6PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712四、TNF-α及其受體—心衰的治療靶點及希望？（一）TNF-α與心肌能量代謝SchematicrepresentationofthemechanismsinvolvedinthemetabolicdysregulationofAC16cellstreatedwithtumournecrosisfactor-α.PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712PublishedonbehalfoftheEuropeanSocietyofCardiology.Allrightsreserved.?TheAuthor2008.Forpermissionspleaseemail:journals.permissions@（二）TNF-α及其受體—心衰的治療靶點及希望？普遍支持慢性心衰患者循環(huán)血中TNF-α水平顯著增高，且增高的程度與CHF的嚴重程度、心功能分級及死亡率呈正相關(guān)。不同病因間（高血壓、冠心病、風濕性心臟病、擴張型心肌?。┧鶎е碌男牧λソ哐h(huán)中TNF-α的含量無明顯統(tǒng)計學差異，提示循環(huán)血中TNF-α增高參與心衰的基本病理過程。LevineB,etal.NEnglJMed.1990;323(4):236-41.KosarF,etal.EurJHeartFail.2006;8(3):270-4.SharmaR,etal.AmJCardiol.2003;15;92(2):188-93.411、臨床研究資料2.實驗動物水平研究1.

轉(zhuǎn)TNF-α基因小鼠出現(xiàn)心衰表現(xiàn)，提示TNF-α與心衰的密切關(guān)系2.TNF基因敲除(TNF-/-)小鼠對腹主動脈縮窄介導的心臟重構(gòu)、炎癥反應等均比C57背景鼠輕得多，而且心功能也明顯改善3.灌注TNF-α可導致大鼠心肌收縮性明顯下降以及心室過度舒張。4.心衰時心臟既是TNF-α作用的靶器官，也是其生物合成的場所。TNF-α的表達水平與心衰的嚴重性相關(guān)，心肌表達TNF-α受體。

ShustermanV,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2010;298(2):H440-50JobeLJ,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2009;297(4):H1462-8；SunM,etal.Circulation.2007;115(11):1398-407.423.靶向TNF-α途徑治療心衰現(xiàn)狀已上市的TNF-α抑制劑：依那西普（Etanercept）、英利昔單抗（Infliximab）和阿達木單抗（Adalimumab）等大分子蛋白藥物。其機制為競爭性和TNF-α結(jié)合，阻斷TNF-α和細胞表面TNF受體結(jié)合，降低TNF-α活性，為非選擇性拮抗TNF-α作用。其臨床適應癥主要為類風濕性關(guān)節(jié)炎等，以往缺乏單純治療心衰治療的大樣本臨床資料。Nurmoham等近期對10.9萬RA患者（其中4.8萬例暴露于抗TNF治療)的大樣本回顧性研究明確：抗TNF治療與未用TNF治療相比顯著減少包括心衰在內(nèi)的多種CV事件發(fā)生的風險。

Nurmoham,etal.AnnRheumDis2012;71(Suppl3):52

。43（三）研究TNFR1亞型及胞外區(qū)的意義TNF受體:目前發(fā)現(xiàn)的有TNFR1和TNFR2，兩種都為跨膜蛋白。TNFR1及TNFR2胞外區(qū)有30%同源性，胞內(nèi)區(qū)無同源性，提示二者介導不同的信號轉(zhuǎn)導機制,TNFR1是TNF-α引發(fā)炎癥反應的主要受體，也是心衰過程中心臟的主要表達受體。TNFR2不能直接激活胞內(nèi)信號通路,亦有研究認為激活TNFR2有助于心衰治療。利用高選擇性多肽或選擇性小分子抑制劑區(qū)分TNFR1不同胞外TNF-α結(jié)合區(qū)，分別研究TNFR1不同胞外區(qū)介導的相關(guān)的胞內(nèi)信號機制，有望發(fā)現(xiàn)適合治療心衰新的靶點、信號途徑及相關(guān)靶基因。44ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002;296(5573):1634-5TNF受體途徑1）TNF－α與TNFR1胞外區(qū)結(jié)合，使TNFR1形成三聚體。

2）三聚體TNFR1通過其聚集的胞內(nèi)區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募下游信號傳導蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。

3）下游信號傳導蛋白形成復合體，激活下游的caspase8以及各種效應分子caspases，產(chǎn)生級聯(lián)激活反應，最終引起靶細胞凋亡。

4）TNF還可通過下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分別激活NIK和MEKK，從而激活NF－KB和c－Jun，抑制細胞凋亡。TNFR1主要通過第2、3功能區(qū)（CRD2,CRD3)與TNF-α相互識別，TNF-α與TNFR1的識別的兩個關(guān)鍵位點分別位于CRD2和CRD3的A1模塊,關(guān)鍵的作用位點存在于A1模塊的疏水區(qū),目前對于TNFR1的研究及TNFR1抑制劑的設計和開發(fā)主要集中在這2個功能區(qū)，特別是針對CRD3已研究出選擇性及抗炎效價較高的環(huán)肽抑制劑（YCWSQYLCY,C-C），但并沒有進行治療心衰效果評價。

TakasakiW,etal.NatBiotechnol1997;15:1266-70MukaiY,etal.JMolBiol2009;385:1221-9

46CRD4亦有非常保守的A1模塊結(jié)構(gòu)，針對于CRD4A1模塊結(jié)構(gòu)疏水區(qū)域的作用研究對于客觀認識TNF-α和TNFR1的結(jié)合模式我們以TNF-R1的胞外CRD4區(qū)的A1模塊疏水區(qū)為模板，設計合成TNFR1衍生小肽序列，并對其進行活性測試，篩選出對TNF-αCRD4區(qū)有較高親和力，可以通過對TNF-α的識別及阻斷作用抑制TNF-α信號傳導較高活性肽Pep3，動物實驗顯示出比Etanercept更好的治療心衰效果，申請并已獲得專利授權(quán)。CaoY,LiuP*.AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-145一種多肽及其在制備抗心衰和炎性反應藥物中的應用，中國發(fā)明專利授權(quán)號：ZL200810218732.2；發(fā)

明

(設計)人：劉培慶;蔣建敏;曹穎男四.針對TNF-α及其受體TNFR1的研究我們利用心梗致心衰大鼠模型比較了Etanercept和我們前期篩選到的TNFR1CRD4區(qū)抑制劑Pep3，發(fā)現(xiàn)盡管Etanercept抑制TNF-α活性作用高于Pep3，但改善心臟功能作用不及Pep3。TNFR1可與TNF-α結(jié)合的胞外端包括CRD3區(qū)和CRD4區(qū)，是否TNF-α與TNFR1CRD3區(qū)、CRD4區(qū)結(jié)合介導的胞內(nèi)信號機制、靶基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控不同？針對TNF-α受體及亞型的選擇性抑制更有利于心衰治療？

(一）建立了針對TNFR1CRD4區(qū)多肽合成、多肽表征鑒定及活性篩選體系1.肽庫的設計及多肽合成以I型TNF受體（TNFR1）N端胞外第四區(qū)域（Domain4）的天然結(jié)構(gòu)為目標，應用組合化學、多肽固相合成技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代合成、分離純化技術(shù)，建立各種不同的多肽衍生物，通過各種波譜分析及HPLC等確定它們的結(jié)構(gòu)純度。小分子肽的合成采用固相Fmoc法，選用2-Chlorotritylchloride樹脂作為固相載體，N,N-二甲基甲酰胺做溶劑，縮合試劑選用二異丙基碳二亞胺，使用ReagentB切除肽鏈和側(cè)鏈保護基，有關(guān)合成技術(shù)已經(jīng)完善。49圖1.

固相Fmoc法合成肽鏈示意圖

502.建立了合成多肽分子量的ESI-MS質(zhì)譜表征分析、多肽純度的HPLC表征分析、合成的粗產(chǎn)品HPLC純化方法及活性分析TNF-αbinding實驗方法254nm214nmFig.2.HPLCanalysisofPep3at254nmand214nm.Fig.3.ESI-MSanalysisofPep3513.證明了已合成的優(yōu)選多肽Pep3具有較高的抑制TNF-α與TNF-R1的結(jié)合活性、抑制HeLa細胞IκB-α降解及NF-κBp65核轉(zhuǎn)位。Fig.4.InhibitionofTNF-αbindingtoTNF-R1bysyntheticpeptidesinELISA.Fig.5.EffectofPep3onTNF-α-induceddegradationofIκB-αinHeLacells.Fig.6.EffectofPep3onTNF-α-inducedNF-κBp65subunitnucleartranslocation.Cao,Y,Liu,P*(劉培慶，通訊作者).AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-14552YuS,LiuP.*(劉培慶，通訊作者).Sirtuin6protectscardiomyocytesfromhypertrophyinvitroviainhibitionofNF-kappaB-dependenttranscriptionalactivity,BrJPharmacol,2012.DOI:10.1111/j.1476-5381.2012.01903.x④發(fā)現(xiàn)Sirt6通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大及炎性反應的作用53⑥建立了巨噬細胞炎癥反應模型，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持。XuS,LiuPQ*（劉培慶，通訊作者）.TanshinoneII-AinhibitsoxidizedLDL-inducedLOX-1expressioninmacrophagesbyreducingintracellularsuperoxideradicalgenerationandNF-κBactivation.TranslRes.2012Aug;160(2):114-24鑒于TNF-α在心衰過程中的重要作用，TNF-α及其受體TNFR1有望成為心衰治療的新途徑及新靶點！六、進一步研究思路通過多肽設計、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及選擇性多肽研究TNF-α通過TNFR1胞外不同區(qū)域介導心衰能量代謝紊亂的機制明確干預TNF-α信號途徑治療心衰可行性，確定具體干預靶點對研發(fā)的高活性高選擇性多肽進行治療心衰的藥效學評價，為進一步小分子化合物的設計及研發(fā)奠定良好的基礎。56短肽庫TNR1活性測試（試劑盒）有機合成靶標（

TNFR1）專利多肽Pep3構(gòu)效關(guān)系分析優(yōu)選多肽Pepx合理化設計結(jié)構(gòu)優(yōu)化細胞活性測試（IC50）小分子抑制劑合理化設計1.多肽設計、合成及優(yōu)化TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式基于晶體結(jié)構(gòu)：1FT4和1TNR58TNF小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設計、合成和活性測試）活性測試分子動力學模擬分子對接小分子數(shù)據(jù)庫大于40萬化合物苗頭化合物目標化合物結(jié)構(gòu)改造有機合成活性測試先導化合物59中國天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（CNPD）(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺為隔離基相聯(lián)結(jié)的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能夠抑制TNF-α和它的受體之間的鏈接。抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合IC50為22μmol/L，而抑制TNF-α誘導的IκB-α解離IC50為4.6μmol/L。2.正在進行TNF小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)生物學與藥物設計實驗室”羅海彬教授課題組合作，以靶蛋白及其受體的復合晶體結(jié)構(gòu)為模板，進行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式及TNF小分子抑制劑的設計、合成和活性測試”。雙方已有良好合作基礎，共同發(fā)表文章如下，為靶向TNF及其受體的小分子抑制劑研發(fā)奠定了良好基礎。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChem

Lett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.Eur

BiophysJ.2012;41(3):297-306.61(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)測定表明抑制劑取代了蛋白質(zhì)的3個亞單元并與TNF-α亞單元二聚體形成配合物。研究者認為,在研究因蛋白質(zhì)解離而使復雜蛋白質(zhì)失活的小分子抑制劑時,這個結(jié)果將有助于鑒定用試樣的設計。①我們用蛋白差異表達技術(shù)研究了SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學，發(fā)現(xiàn)了18個差異表達蛋白，其中12個是能量代謝密切的酶,為心肌肥大及心衰的能量代謝異常學說提供了重要依據(jù)。②建立了慢性心衰能量代謝相關(guān)的信號通路、基因及線粒體功能、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳等分析方法，證明了能量代謝異常在心肌肥大及心衰病理過程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點變化及調(diào)控機制④發(fā)現(xiàn)Ⅲ型組蛋白去乙?；福⊿irt）通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大作用，為心肌肥大的炎性反應及心衰的表觀遺傳調(diào)控提供了依據(jù)⑤對心肌肥大及心衰病理過程中細胞內(nèi)信號分子的相互作用及網(wǎng)絡聯(lián)系進行了系統(tǒng)研究，特別是核受體及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控分析，證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用。⑥建立了巨噬細胞炎癥反應模型，證明了中藥單體丹參酮ⅡA主要通過抑制細胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制炎癥反應作用，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持主要內(nèi)容正常心肌能量代謝CHF心肌能量代謝變化CHF的代謝療法展望正常心肌的能量代謝過程（三）：ATP的轉(zhuǎn)移和利用心臟收縮肌酸激酶能量穿梭機制

MitochondriacytoplasmATPADP+線粒體肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）肌纖維肌酸激酶ADP+

磷酸肌酸（PCr）+肌酸（Cr）ATP能量代謝與心肌肥大心衰關(guān)系①我們用蛋白差異表達技術(shù)研究了SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學，發(fā)現(xiàn)了18個差異表達蛋白，其中12個是能量代謝密切的酶,為心肌肥大及心衰的能量代謝異常學說提供了重要依據(jù)。②建立了慢性心衰能量代謝相關(guān)的信號通路、基因及線粒體功能、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳等分析方法，證明了能量代謝異常在心肌肥大及心衰病理過程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點變化及調(diào)控機制④發(fā)現(xiàn)Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶（Sirt）通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大作用，為心肌肥大的炎性反應及心衰的表觀遺傳調(diào)控提供了依據(jù)⑤對心肌肥大及心衰病理過程中細胞內(nèi)信號分子的相互作用及網(wǎng)絡聯(lián)系進行了系統(tǒng)研究，特別是核受體及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控分析，證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用。⑥建立了巨噬細胞炎癥反應模型，證明了中藥單體丹參酮ⅡA主要通過抑制細胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制炎癥反應作用，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機制：心肌細胞功能異常：收縮蛋白等；心肌細胞數(shù)量減少：凋亡，自噬等；心肌微血管障礙；細胞外間質(zhì)增加。研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機制：心肌細胞功能異常：收縮蛋白等；心肌細胞數(shù)量減少：凋亡，自噬等；心肌微血管障礙；細胞外間質(zhì)增加。研究背景心肌細胞凋亡是使心肌肥厚從“代償”向“失代償”轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一，是心力衰竭進行性惡化的重要基礎。心肌細胞自噬是心肌對壓力超負荷的適應性反應之一；自噬反應的異常也是導致心臟功能低下的原因。中藥“芪藶強心膠囊”治療慢性心衰實驗研究文獻資料：鄒云增，上海市心血管病研究所心肌細胞凋亡與心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:TransverseaortaconstrictionHypertensioninRevisingWT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction心肌細胞凋亡與心力衰竭心肌細胞自噬與心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction芪藶強心膠囊對壓力超負荷2周心肌細胞肥大的影響芪藶強心膠囊對壓力超負荷4周心肌纖維化的影響芪藶強心膠囊對壓力超負荷4周心肌細胞凋亡的影響(TUNEL)芪藶強心膠囊對壓力超負荷4周心肌細胞自噬的影響(LC3b)#*###芪藶強心膠囊對壓力超負荷4周心肌細胞自噬的影響(LC3b)小結(jié)芪藶強心膠囊：—延緩壓力超負荷后心室重構(gòu)的發(fā)生；—保護壓力超負荷后的心臟收縮功能；—減少壓力超負荷晚期的心肌細胞凋亡和自噬四、進一步研究思路通過多肽設計、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及選擇性多肽研究TNF-α通過TNFR1胞外不同區(qū)域介導心衰能量代謝紊亂的機制明確干預TNF-α信號途徑治療心衰可行性，確定具體干預靶點對研發(fā)的高活性高選擇性多肽進行治療心衰的藥效學評價，為進一步小分子化合物的設計及研發(fā)奠定良好的基礎。79短肽庫TNR1活性測試（試劑盒）有機合成靶標（

TNFR1）專利多肽Pep3構(gòu)效關(guān)系分析優(yōu)選多肽Pepx合理化設計結(jié)構(gòu)優(yōu)化細胞活性測試（IC50）小分子抑制劑合理化設計1.多肽設計、合成及優(yōu)化TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式基于晶體結(jié)構(gòu)：1FT4和1TNR81TNF小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設計、合成和活性測試）活性測試分子動力學模擬分子對接小分子數(shù)據(jù)庫大于40萬化合物苗頭化合物目標化合物結(jié)構(gòu)改造有機合成活性測試先導化合物82(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺為隔離基相聯(lián)結(jié)的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能夠抑制TNF-α和它的受體之間的鏈接。抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合IC50為22μmol/L，而抑制TNF-α誘導的IκB-α解離IC50為4.6μmol/L。2.正在進行TNF小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)生物學與藥物設計實驗室”羅海彬教授課題組合作，以靶蛋白及其受體的復合晶體結(jié)構(gòu)為模板，進行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式及TNF小分子抑制劑的設計、合成和活性測試”。雙方已有良好合作基礎，共同發(fā)表文章如下，為靶向TNF及其受體的小分子抑制劑研發(fā)奠定了良好基礎。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChem

Lett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.Eur

BiophysJ.2012;41(3):297-306.84(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)測定表明抑制劑取代了蛋白質(zhì)的3個亞單元并與TNF-α亞單元二聚體形成配合物。研究者認為,在研究因蛋白質(zhì)解離而使復雜蛋白質(zhì)失活的小分子抑制劑時,這個結(jié)果將有助于鑒定用試樣的設計。3.心肌細胞模型指標檢測①心肌能量代謝狀態(tài)及線粒體功能檢測:已建立了HPLC及磁共振波譜（mrs）檢測心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平的方法:PCr作為輸送ATP從線粒體到細胞質(zhì)的工具，是能量物質(zhì)的中介，PCr/ATP比值是分析能量代謝的最重要參數(shù)，其準確度高于NYHA分級等臨床參數(shù)和左室EF等功能參數(shù)②TMRE染料檢測心肌線粒體膜電位、透射電鏡觀察線粒體功能與生成狀態(tài)

③心肌細胞脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代謝關(guān)鍵基因如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等mRNA等蛋白表達水等變化④測定心肌細胞表面積、檢測[3H]亮氨酸攝入率及肥大及心衰相關(guān)基因ANF、BNP的mRNA及蛋白表達水平

通過以上指標體系檢測,綜合分析TNF-α通過是否通過TNFR1不同功能區(qū)發(fā)揮對肥大重構(gòu)及缺血心肌能量代謝的調(diào)控作用。4.系統(tǒng)建立治療心衰藥物的基礎研究及評價體系

①超聲心動及心臟插管法檢測心臟收縮及舒張功能②心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平HPLC及磁共振波譜（mrs）檢測方法③TMRE染料檢測心肌線粒體膜電位、透射電鏡觀察線粒體功能與生成狀態(tài)

④Clark氧電極法檢測心肌線粒體耗氧速率⑤脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代謝關(guān)鍵基因及蛋白如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等變化；872.TNFR1不同胞外區(qū)介導的胞內(nèi)信號機制利用培養(yǎng)的心肌細胞，以不同濃度TNF-α為誘導劑誘導細胞炎性反應及能量代謝障礙，比較分別給予Pepx（作用于CRD4）和環(huán)肽（C-C，作用于CRD3），觀察對細胞功能和能量代謝主要指標的影響，研究TNF-α通過TNFR1不同胞外區(qū)介導的相關(guān)的胞內(nèi)信號機制，探討TNF-α調(diào)控心肌能量代謝的受體機制及信號通路。883.干預TNFR1不同胞外區(qū)對模型動物心衰治療效果評價及機制研究1）利用冠狀動脈左前降支結(jié)扎復制SD大鼠心衰模型，經(jīng)超聲心動圖、血流動力學分析以及組織病理檢測等方法檢測Pepx和環(huán)肽（C-C）對心臟功能的影響，探討干預TNFR1與TNF-α結(jié)合的不同胞外區(qū)對心衰治療效果，明確干預TNF-α信號途徑治療心衰的靶點，并進行治療心衰的藥效學評價指標體系：增加Clark氧電極法檢測心肌線粒體耗氧速率，其他指標同心肌細胞。2）Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型，進行優(yōu)選多肽Pepx或篩選出的先導化合物的抗心衰作用藥效學評價指標體系：增加犬冠脈流量測定及心肌酶譜檢測，其它同大鼠心衰模型89研究內(nèi)容概括如下三、工作基礎近年來在負責的6項國家自然科學基金面上項目(包括中加合作項目)及廣東省自然科學基金團隊項目、重點項目支持下，圍繞高血壓心肌肥大、心衰等進行了系統(tǒng)的病理機制及藥物干預靶點研究，建立了心肌肥大、心衰研究模型及靶點研究方法。負責承擔了科技部十一五“重大新藥創(chuàng)制”專項“新藥臨床前藥效學評價技術(shù)平臺”（2009ZX09303-007）“心腦血管疾病藥物藥效學評價平臺”建設，建立了完善的治療心衰等心腦血管疾病藥物臨床前藥效學評價模型及技術(shù)體系（已順利結(jié)題）。3.建立了心衰評價模型及藥效評價指標體系①大鼠心衰模型及評價指標體系:冠狀動脈左前降支結(jié)扎的SD大鼠心衰模型ChenY,LiuP*.MolCellEndocrinol.2012;362(1-2):11-18②Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型及評價指標體系，完成了中藥單體前胡丙素及1類化藥TBN(暨南大學委托）的抗心衰藥效學評價。（三）開展了治療心衰藥物的研發(fā)工作指導了本課題直接相關(guān)的博士研究生曹穎男順利畢業(yè)并已獲得博士學位，學位論文題目《多肽類腫瘤壞死因子alpha抑制劑的設計、合成及抗炎活性研究》，為本課題的實施奠定了良好基礎。獲得了活性多肽Pep3在制備抗心衰和炎性反應藥物中的應用的中國發(fā)明專利授權(quán)號，為進一步作為治療心衰藥物研發(fā)提供了知識產(chǎn)權(quán)保護。931.JCardiovascPharmacol.2012Jun;59(6):500-6.doi:10.1097/FJC.0b013e31824c853c.AtorvastatinattenuatesTNF-α-inducedincreaseofglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes.GaoF,NiY,LuoZ,LiangY,YanZ,XuX,LiuD,WangJ,ZhuS,ZhuZ.DepartmentofCardiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,China.Recentstudieshaveshownthatatorvastainhasanti-inflammatoryeffectandcanpreventcardiachypertrophy.Thedevelopmentofcardiachypertrophyanddysfunctionisassociatedwithanincreaseincardiacglucoseutilization.Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofatorvastatinonglucoseoxidationintumornecrosisfactorα(TNF-α)-stimulatedcardiomyocytes(H9c2cells)andthepotentialroleofperoxisomeproliferation-activatedreceptorcoactivator1α(PGC-1α)inthiseffect.ExposureofH9c2cellstoTNF-αinhibitedtheexpressionsofPGC-1α,pyruvatedehydrogenasekinase4,andcarnitinepalmityltransferase1andinducedasignificantincreaseinglucoseoxidationrate.However,theeffectsofTNF-αweresignificantlyreversedbyatorvastatin.SelectivesilenceofPGC-1αinH9c2cellsresultedinthedownregulationofpyruvatedehydrogenasekinase4andcarnitinepalmityltransferase1andfurtherincreasedtheTNF-α-inducedglucoseoxidation.Interestingly,theeffectofatorvastatinonPGC-1αwasalmostabolishedbymevalonateandpartiallybyfarnesolbutnotbygeranylgeraniol.Inconclusion,atorvastatininhibitsTNF-α-inducedglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes,whichmightbeassociatedwiththeregulationofisoprenoidmetabolites.AIMS:Inflammatoryresponsesintheheartthataredrivenbysustainedincreasesincytokineshavebeenassociatedwithseveralpathologicalprocesses,includingcardiachypertrophyandheartfailure.Emergingdatasuggestalinkbetweencardiomyopathyandmyocardialmetabolismdysregulation.Tofurtherelucidatetherelationshipbetweenapro-inflammatoryprofileandcardiacmetabolismdysregulation,ahumancelllineofcardiacorigin,AC16,wastreatedwithtumournecrosisfactor-alpha(TNF-alpha).METHODSANDRESULTS:ExposureofAC16cellstoTNF-alphainhibitedtheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator1alpha(PGC-1alpha),anupstreamregulatoroflipidandglucoseoxidativemetabolism.Studiesperformedwithcardiac-specifictransgenicmice(Musmusculus)overexpressingTNF-alpha,whichhavebeenwellcharacterizedasamodelofcytokine-inducedcardiomyopathy,alsodisplayedreducedPGC-1alphaexpressionintheheartcomparedwiththatofcontrolmice.ThemechanismbywhichTNF-alphareducedPGC-1alphaexpressioninvitroappearedtobelargelymediatedviabothp38mitogen-activatedproteinkinaseandnuclearfactor-kappaBpathways.PGC-1alphadownregulationresultedinanincreaseinglucoseoxidationrate,whichinvolvedareductioninpyruvatedehydrogenasekinase4expressionanddependedontheDNA-bindingactivityofbothperoxisomeproliferator-activatedreceptorbeta/deltaandestrogen-relatedreceptoralphatranscriptionfactors.CONCLUSION:TheseresultspointtoPGC-1alphadownregulationasapotentialcontributortocardiacdysfunctionandheartfailureinmetabolicdisorderswithaninflammatorybackground.FAsenterthecardiomyocytethroughspecifictransporters,andtheyareconvertedtoacyl-CoAbyacyl-CoAsynthethase(ACS).Acyl-CoAsmightbeusedforβ-oxidation(bluepathway),ortheycanbedivertedtonon-oxidativepathways,includingesterificationandTGsynthesis(pinkpathway)andformationoflipotoxicintermediates,namelyceramides(Cer)(bottom,greenpathway).Reactiveoxygenspecies(ROS)anddiacylglycerol(DAG),resultingfromoxidationoresterification,arealsotoxicintermediates.IntracellularTGmayaccumulateinlipoproteins(topleft,purplepathway)tobeeventuallyreleasedinthecirculation,orbehydrolyzedbyadiposetissuetriglyceridelipase(ATGL),leadingtointracellularreleaseofFA.IntracellularFAscanfollowoneofthepathwaysmentionedabove,withfurtheraccumulationofcytotoxicmolecules.Potentiallytoxicproductsareshowninorange.Abbreviations:Acyl-CoA:acylcoenzymeA.ACS:acyl-CoAsynthetase.AGPAT:acylglycerolphosphateacyltransferase.ApoB:apolipoproteinB.ATGL:adiposetissuetriglyceridelipase.Cer:ceramide.CPT1:carnitinepalmitoyltransferase-1.DAG:diacyloglycerol.DGAT1:diacylglycerol-acyltransferase1.ER:endoplasmicreticulum.FA:fattyacid.FABP:fattyacidbindingprotein.FATP:fattyacidtransportprotein.GPAT:glycerolphosphateacyltransferase.HSL:hormonesensitivelipase.LpL:lipoproeinlipase.m-/c-lipoprotein:cardiomyocytereleased/circulatinglipoprotein.MG:monoacylglycerol.Mit:mitochondrion.MTP:microsomaltriglyceridetransferprotein.PM:plasmamembrane.ROS:reactiveoxygenspecies.Sph:sphingosine.SPT:serinepalmitoyl-transferase.TCA:tricarboxylicacidcycle.TG:triglyceridePGC-1αandPDK4expressionisdownregulatedbytumournecrosisfactor-αinAC16cells(A)andinleftventricletissueoftransgenicTNF1.6mice(B)inaprocessmediatedbynuclearfactor-κB(C)andp38mitogen-activatedproteinkinase(D).AC16cellswereincubatedwithtumournecrosisfactor-α(A,C,andD)inthepresenceorabsenceofparthenolide(10μmol/L,C)orPD169316(10μmol/L,D).Thepanelsdisplayarepresentativeautoradiogramofthereversetranscription–polymerasechainreactionanalysisofthecorrespondingmRNAlevels.Graphicsrepresentthequantificationofthe18S-normalized(A,C,andD)orAprt