致熱性 醫(yī)療器械熱原試驗的原理和方法 征求意見稿

`Pyrogenicity—PrinciplesandmethodsforpyrogentestingofmedicaldevicesIGB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021 II III 42規(guī)范性引用文件 43術語和定義 44縮略語 55熱原表征 55.1概述 55.2細菌內(nèi)毒素 65.3除內(nèi)毒素以外的微生物成分 65.4促炎細胞因子 65.5化學物質(zhì)和其他熱原 65.6發(fā)熱反應的原理 76致熱性評估 76.1概述 76.2細菌內(nèi)毒素試驗(BET) 76.2.1概述 76.2.2LAL反應的原理 86.2.3BET的一般步驟 86.2.4BET的特性 86.3家兔熱原試驗 86.3.1概述 86.3.2家兔試驗的原理 96.3.3家兔試驗的步驟 96.3.4家兔試驗的特點 96.4HCPT 96.4.1概述 96.4.2HCPT的原理 96.4.3人類細胞的選擇 96.4.4細胞因子標志物的選擇 106.4.5HCPT的步驟 106.4.6HCPT的特性 116.4.7確認研究 117結(jié)論 12 13GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件等同采用ISO/TR21582:2021《致熱性醫(yī)療器械熱原試驗的原理和方法》，文件類型由ISO的技術報告調(diào)整為我國的指導性技術文件。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。本文件由全國醫(yī)療器械生物學評價標準化技術委員會（SAC/TC248）歸口。本文件起草單位：本文件主要起草人：GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021目前，醫(yī)療器械的安全評估過程以GB/T(Z)16886（所有部分）中推薦的毒理學研究和其他研究為指導。材料介導的致熱性表現(xiàn)為一種全身反應，雖然在GB/T16886.11-2021附錄G中有涉及，但本文件致力于對熱原試驗進行總體描述。熱原反應是指化學物質(zhì)或其他物質(zhì)的不良反應，如微生物成分引起的發(fā)熱反應。熱原反應試驗已被要求用于評價直接或間接接觸循環(huán)血液和淋巴系統(tǒng)、腦脊液（CSF）和與人體相互作用的產(chǎn)品的安全性。目前，家兔體內(nèi)致熱性試驗和體外細菌內(nèi)毒素試驗已作為評價醫(yī)療器械及其材料致熱性的公認方法。國際上對已經(jīng)建立的試驗方法包含試驗樣品的制備方式已經(jīng)達成共識，并且在相關的指南和藥典均有體近來，一種使用人免疫細胞進行的體外熱原試驗，即基于人體細胞的熱原試驗(HCPT)，已經(jīng)被開發(fā)出來并應用于非腸道藥物的熱原試驗。由于該方法直接或間接接觸人體血細胞，目前正在考慮將其應用于醫(yī)療器械熱原檢測。4GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021致熱性醫(yī)療器械熱原試驗的原理和方法本文件規(guī)定了醫(yī)療器械及其材料的熱原試驗的原理和方法。本文件適用于醫(yī)療器械及其材料的熱原試驗。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。ISO和IEC維護的用于標準化的術語數(shù)據(jù)庫，地址如下：——IEC電子百科：/；——ISO在線瀏覽平臺：/obp。3.1醫(yī)療器械medicaldevice制造商的預期用途是為下列一個或多個特定醫(yī)療目的用于人類的，不論單獨使用或組合使用的儀器、設備、器具、機器、用具、植入物、體外應用試劑或校準品、軟件、材料或者其他相似或相關物品。這些目的是：——疾病的診斷、預防、監(jiān)護、治療或者緩解；——損傷的診斷、監(jiān)護、治療、緩解或者補償；——解剖或生理過程的研究、替代、調(diào)節(jié)或者支持；——支持或維持生命；——妊娠控制；——醫(yī)療器械的消毒；——通過對取自人體的樣本進行體外檢查來提供醫(yī)療信息；其作用于人體體表或體內(nèi)的主要設計作用不是用藥理學、免疫學或代謝的手段獲得，但可能有這些手段參與并起一定的輔助作用。注：在某些監(jiān)管機構(gòu)認為是醫(yī)療器械，但在其他監(jiān)管機構(gòu)則不被認——消毒物質(zhì)；——殘疾人員的輔助用品；——含有動物和/或人類組織的器械；——體外受精或輔助生殖技術的器械。[來源：GHTF/SG1/N071：2012，5.1]3.2熱原pyrogen引起發(fā)熱的物質(zhì)。3.3致熱性pyrogenicity化學物質(zhì)或其他物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)熱反應的能力。3.45GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021發(fā)熱反應febrileresponse由于調(diào)定點溫度的升高引起體溫高于正常范圍。注：也稱為發(fā)燒或發(fā)熱。3.5氧化磷酸化oxidativephosphorylation大多數(shù)需氧生物的代謝途徑，這種途徑下利用酶氧化營養(yǎng)物質(zhì)并釋放能量。4縮略語下列縮略語適用于本文件。COX：環(huán)氧化物酶（enzymecyclooxygenase）CpG：DNA序列中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）相鄰，p表示C和G由磷酸二酯鍵連接。甲基基團位于胞嘧啶環(huán)的5號位[cytosine(C)nexttoguanine(G)intheDNAsequence,withthepindicatingthatCandGareconnectedbyaphosphodiesterbond.methylgrouptothe5positionofthecytosinepyrimdinering]ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗HCPT，如單核細胞活化試驗(MAT)[enzymelinkedimmunosorbentassayHCPT,e.g.monocyteactivationtest(MAT)]IKK：IkB激酶，一種參與增強細胞對炎癥反應的酶復合體（IkBkinase,anenzymecomplexinvolvedinpropagatingcellularresponsetoinflammation）IRAK：人白介素1受體相關激酶（interleukin-1receptor-associatedkinase）LAL：鱟試劑（limulusamebocytelysate）LPS：脂多糖（lipopolysaccharide）MD-2：結(jié)合于TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域的分子分泌糖蛋白（moleculesecretedglycoproteinthatbindstoextracellulardomainofTLR4）MCP：巨噬細胞趨化蛋白（macrophagechemotacticprotein）MIP：巨噬細胞炎性蛋白（macrophageinflammatoryprotein）NOD：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白（nucleotide-bindingoligomerizationdomain）PGE2：前列腺素E2（prostaglandinE2）PANTES：受激活調(diào)節(jié)，正常T表達和分泌（regulatedonactivation,normalT-expressedandSecreted）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）SEA：葡萄球菌腸毒素A（staphylococcalenterotoxinA）SpeC：鏈球菌致熱性外毒素C（streptococcalpyrogenicexotoxinC）SpeF：鏈球菌致熱性外毒素F（streptococcalpyrogenicexotoxinF）TBK：TANK結(jié)合激酶（TANKbindingkinase）TLR：Toll樣受體（Toll-likereceptor）TNF：腫瘤壞死因子（tumournecrosisfactor）TSST：中毒性休克綜合征毒素（toxicshocksyndrometoxin）5熱原表征5.1概述根據(jù)熱原的來源，發(fā)熱反應分為以下三種類型：a)由化學物質(zhì)引起的材料介導的致熱性；b)內(nèi)毒素介導的致熱性；c)由除內(nèi)毒素外的其他微生物成分介導的致熱性。6GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021非內(nèi)毒素介導的熱原性對應于源自上述a)和c)的發(fā)熱反應的通用名稱。然而，b)能與材料介導的致熱性明顯區(qū)分，因為發(fā)熱反應起源于微生物污染。TLRs是一類構(gòu)成免疫系統(tǒng)抵御微生物感染的重要組成部分的蛋白質(zhì)，與微生物成分的致熱性密切相關。迄今為止，已鑒定出13種人體TLR（包括TLR1到TLR13）以及對其中一些受體的激動劑。能在醫(yī)療器械領域進行評估的大多數(shù)熱原可能源自于微生物的生物活性物質(zhì)，這些微生物來源于器械制造過程的污染物或材料本身。由于這些成分是TLR激動劑，并且在人體為熱原，因此TLR知識對于理解熱原非常重要。5.2細菌內(nèi)毒素細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要成分，是被TLR4識別的最強的熱原。內(nèi)毒素是宿主免疫反應的調(diào)節(jié)劑，表現(xiàn)出多種生物活性，如巨噬細胞的活化、有絲分裂性和佐劑性，除致熱性外，還引起施瓦茨曼反應（Schwartzmanreactions）。從臨床角度看，內(nèi)毒素引起的膿毒癥、膿毒性休克和多器官衰竭，是死亡率較高的全身性疾病。內(nèi)毒素通常由多糖O抗原、核心低聚糖和類脂A組成，類脂A是內(nèi)毒素的生物活性中心。內(nèi)毒素的效力受乙?；土姿峄揎椧约邦愔珹中與磷酸殘基結(jié)合的極性頭基存在/缺失的影響。此外，內(nèi)毒素的生物活性的表達具有種屬特異性。在自然界中，革蘭氏陰性菌廣泛分布于水（江河和海洋）、空氣、土壤和人體中。因此，由天然物質(zhì)制成的生物材料很可能被細菌及其成分所污染。制造過程中的高壓蒸汽滅菌、輻照和氣體滅菌能夠殺滅細菌。然而，微生物成分特別是內(nèi)毒素不能用普通滅菌方法滅活，一旦被污染，在制造過程中很難去除內(nèi)毒素。在制造過程中，能通過除熱原（例如：250℃持續(xù)30min，使用化學物質(zhì)如多粘菌素-B滅活內(nèi)毒素，或在清洗和制造過程中使用無內(nèi)毒素水）來減少或消除內(nèi)毒素污染。5.3除內(nèi)毒素以外的微生物成分微生物產(chǎn)生除內(nèi)毒素以外的各種生物活性物質(zhì)。脂磷壁酸是革蘭氏陽性細菌細胞壁的重要組成部分，是內(nèi)毒素的類似物，作為TLR2識別的熱原，與TLR1或TLR6相互作用并形成異二聚體。脂蛋白、脂肽和阿拉伯甘露聚糖是各種微生物的細胞成分，也被稱為TLR2激動劑。雖然構(gòu)成革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌細胞壁的肽聚糖均被認為是TLR2激動劑，但最近有研究表明，NOD1和NOD2蛋白而非TLR2介導其生物活性表達。此外，病毒雙鏈RNA、細菌鞭毛、細菌和病毒CpGDNA分別被鑒定為TLR3、TLR5和TLR9的激動劑，它們對人類都是致熱原。雖然還沒有報道任何一種（1,3）-β-D-葡聚糖的致熱性，但可以注意到，某些種類的（1,3）-β-D-葡聚糖能增強內(nèi)毒素毒性。據(jù)報道，各種病原微生物產(chǎn)生的外毒素和腸毒素，如TSST-1、SEA、SpeF和SpeC，通過毒素特異性方式引起人體發(fā)熱反應，這可能不同于TLR信號轉(zhuǎn)導。曾由于透析期間溶液被肽聚糖污染，一些患者出現(xiàn)炎癥、發(fā)熱和腹膜炎。5.4促炎細胞因子由于TLR激動劑誘導的發(fā)熱反應是由人免疫細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子介導的，如TNFα、白細胞介素-1β（IL-1β)、白細胞介素-6（IL-6）和γ-干擾素(IFN-γ)，因此內(nèi)源性物質(zhì)本身起到熱原的作用。除了TLRs外，單核細胞和巨噬細胞的表面存在其他細胞因子的特異性受體，因此每種細胞因子通過激活細胞因子網(wǎng)絡進一步激活免疫細胞。5.5化學物質(zhì)和其他熱原除微生物成分外，尚不清楚其他化學物質(zhì)或天然物質(zhì)的致熱性。此外，全世界每年都發(fā)現(xiàn)或合成超過1000多種新的化合物，但每種化合物的生物學特性還不清楚。目前用于醫(yī)療器械生物材料的大多數(shù)化學物質(zhì)都是安全的，而且對人類不具有致熱性。然而，一些新的生物材料和化學物質(zhì)可能會引起人體發(fā)熱反應。這種可能性也適用于非自體細胞產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可能引起免疫活性細胞的免疫識別和激活。7GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021例如，下面列出了已知的能夠引起人體發(fā)熱反應的化學物質(zhì)。根據(jù)誘導發(fā)熱反應的原理，這些化學物質(zhì)主要可分為三組：a)直接刺激大腦和神經(jīng)系統(tǒng)體溫調(diào)節(jié)中樞的物質(zhì)，b)氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，c)機制尚不清楚的熱原。下面列出的化學物質(zhì)已知會引起人體的發(fā)熱反應：——前列腺素；——誘導劑(例如：多聚腺苷酸、多聚尿苷酸、多聚生物腺苷酸和多聚核糖苷酸)；——干擾溫度調(diào)節(jié)中樞功能的物質(zhì)(例如：麥角酸二乙酰胺、可卡因、嗎啡)；——神經(jīng)遞質(zhì)(例如：去甲腎上腺素、血清素)；——氧化磷酸化解偶聯(lián)劑（例如：4,6-二硝鄰甲酚、二硝基苯酚、苦味酸）；——N-苯基-β-萘胺和aldo-α-萘胺（其發(fā)熱機制未知）；——在某些情況下的金屬，如鎳鹽。除了這些化學物質(zhì)，還有一種可能是微球和納米顆粒，包括植入物衍生的磨損碎片可能為熱原。由特定尺寸組成的微球、顆粒和納米顆?？杀痪奘杉毎淌桑⒓せ罹奘杉毎尫诺拇傺准毎蜃尤鏣NFα。TNFα是內(nèi)源性熱原之一。5.6發(fā)熱反應的原理TLRs是一類單次跨膜非催化受體，一旦微生物突破皮膚或腸道黏膜等物理屏障并激活免疫細胞，它們就會識別源自微生物的結(jié)構(gòu)保守分子。它們在固有免疫系統(tǒng)中起關鍵作用，并且以二聚體的形式發(fā)揮作用。雖然大多數(shù)TLRs似乎是同型二聚體，但TLR2與TLR1或TLR6形成異型二聚體，每個二聚體具有不同的配體特異性。TLRs還可能依靠其他共受體來獲得完全的配體敏感性，例如在TLR4識別內(nèi)毒素的情況下，還需要MD-2分子。已知CD14和LPS結(jié)合蛋白有助于內(nèi)毒素向MD-2的呈遞。當被激活時，TLRs在細胞的細胞質(zhì)內(nèi)招募銜接分子以傳播信號。已知有四種銜接分子參與信號傳遞，分別是MyD88、Tirap(也稱為Mal)、Trif和Tram。這些銜接分子激活細胞內(nèi)的其他分子，包括某些蛋白激酶(IRAK1、IRAK4、TBK1和IKKi)。這些蛋白激酶可以放大信號，并最終導致協(xié)調(diào)炎癥反應的基因(NF-κB、AP-1和IRP3)的誘導或抑制。在被微生物來源的配體激活后，可能會發(fā)生幾種反應。免疫細胞能產(chǎn)生引發(fā)炎癥的細胞因子，特別是IL-1β與誘導發(fā)熱反應密切相關。IL-6和TNFα后來被分離出來，并且也被發(fā)現(xiàn)是細胞因子，盡管劑量要高得多。目前認為哺乳動物發(fā)熱機制是促炎細胞因子導致了介導PGE2合成的COX-2的表達。COX-2敲除小鼠不會對LPS、IL-1或IL-6產(chǎn)生發(fā)熱反應，而PGE2觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)，從而改變體溫的調(diào)定點。因此，IL-1β、IL-6和TNFα是免疫細胞與致熱原接觸時釋放的介質(zhì)，負責觸發(fā)大腦中的發(fā)熱反應。已知P物質(zhì)通過產(chǎn)生TNF-α、IL-6和PGE2來誘導發(fā)熱。TLRs似乎參與了細胞因子的產(chǎn)生和細胞活化，以及微生物和其他潛在熱原的黏附和吞噬。在不依賴于TLR信號通路和隨后的細胞因子的產(chǎn)生的情況下，物質(zhì)可通過直接刺激體溫調(diào)節(jié)中樞來提高體溫。此外，氧化磷酸化解偶聯(lián)劑能通過激活線粒體中的電子傳遞鏈而使體溫升高。6致熱性評估6.1概述有三種用于致熱性試驗的方法，如下所述。根據(jù)熱原的定義，家兔體內(nèi)熱原試驗是唯一一種直接測定體內(nèi)發(fā)熱反應作為終點的試驗，而其他兩種方法均未涉及。相反，體外試驗方法使用不同的終點檢測熱原，如細胞因子的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)凝固。6.2細菌內(nèi)毒素試驗(BET)6.2.1概述8GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021BET在各國藥典中的描述是一致的。本試驗使用從鱟（美洲鱟和中華鱟）的循環(huán)變形細胞提取的溶解物試劑，定性或定量檢測革蘭氏陰性細菌來源的細菌內(nèi)毒素。BET分為兩種方法：一種是鱟試劑與內(nèi)毒素反應形成凝膠的凝膠法，另一種是內(nèi)毒素引起鱟試劑發(fā)生光學變化的光度法。后者進一步細分為兩種方法：一種是濁度法，根據(jù)伴隨凝膠形成產(chǎn)生的濁度變化來測定樣品溶液的內(nèi)毒素濃度；另一種是顯色基質(zhì)法，通過測定合成顯色底物釋放的呈色團顏色的光密度來計算內(nèi)毒素濃度，該底物是下文所述酶聯(lián)反應最后步驟的取代基。每種光度法均可分為終點法和動態(tài)法。BET能從常規(guī)質(zhì)量控制的角度監(jiān)測醫(yī)療器械生產(chǎn)過程和終產(chǎn)品的內(nèi)毒素污染情況。在開始使用從中華鱟中提取的鱟試劑之前，該試驗在過去被稱為美洲鱟試劑反應。也有其他可用于檢測細菌內(nèi)毒素的方法，例如，使用重組C因子熒光檢測法，見參考文獻[6]。6.2.2鱟試劑反應的原理BET是一種酶促級聯(lián)反應，對定性和定量檢測革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素具有最高的敏感性。首先，內(nèi)毒素激活C因子，即存在于鱟試劑中的內(nèi)毒素敏感絲氨酸蛋白酶酶原?；罨疌因子將B因子從非活性形式轉(zhuǎn)化為活性形式，進一步將凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶。最后，凝固酶將凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝固蛋白，形成凝膠。除C因子外，鱟試劑還含有G因子，可被（1,3）-β-D-葡聚糖激活，隨后將凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶。已通過去除G因子或其功能開發(fā)出內(nèi)毒素特異性鱟試劑。由于BET基于酶促反應，因此受樣品溶液的溫度和pH的影響，也會被各種化合物（如一定濃度的蛋白酶、蛋白酶抑制劑、金屬離子、表面活性劑、螯合物、鹽和糖）增強或抑制。因此，能通過對干擾因子的檢測，測定樣品溶液中反應的抑制劑和增強劑。通過對樣品溶液的稀釋能避免干擾因子的影響。6.2.3BET的一般步驟定性和定量檢測內(nèi)毒素的一般方法已經(jīng)在一些國家的藥典和AAMIST72中進行了討論。細節(jié)見這些文件。需要注意的是，除非另有說明，選用無熱原水作為制備樣品溶液的浸提介質(zhì)。醫(yī)療器械及其材料中存在的內(nèi)毒素通常是在室溫下提取的。6.2.4BET的特性鱟試劑反應是一種簡單快速的檢測內(nèi)毒素的方法，具有高靈敏度，能檢測醫(yī)療器械上存在的革蘭氏陰性細菌污染。內(nèi)毒素具有的種屬特異性毒性表達取決于脂質(zhì)A部分的化學結(jié)構(gòu)。與內(nèi)毒素的其他生物學特性（如炎癥細胞釋放細胞因子）相比，內(nèi)毒素對鱟試劑活性的結(jié)構(gòu)要求并不嚴格，因此BET比基于人體細胞的熱原試驗具有更廣泛的內(nèi)毒素檢測譜。醫(yī)療器械上的內(nèi)毒素污染能表明更廣泛的微生物污染。然而，器械上的內(nèi)毒素含量與器械上的其他微生物數(shù)量沒有相關性。BET僅對革蘭氏陰性菌或內(nèi)毒素污染具有特異性。從歷史上看，在醫(yī)療器械制造中可控制的主要和最強的熱原污染物是細菌內(nèi)毒素。由于細菌內(nèi)毒素在自然界中無處不在、穩(wěn)定，且足夠小可以穿透傳統(tǒng)的滅菌過濾器，因此很難預防細菌內(nèi)毒素污染。然而，上述BET的特性不僅有優(yōu)點，也有缺點。最重要的缺點是BET不能檢測除內(nèi)毒素以外的熱原。此外，由于對毒性表達結(jié)構(gòu)的高度要求，人們對人體活性內(nèi)毒素種類的認識有限，因此BET并不能完全反映人體的熱原反應。器械制造商從醫(yī)療器械中提取內(nèi)毒素，從而得到器械中內(nèi)毒素的回收提取效率低于100%。在某些情況下，吸附在某些塑料、陶瓷或金屬和某些天然產(chǎn)物上的內(nèi)毒素不能通過一般的使用水進行提取的方法有效地回收。然而，經(jīng)過多年監(jiān)管證據(jù)證明，被美國食品和藥品監(jiān)管局以及其他國家藥典所推薦的浸提方法，已經(jīng)足以確保在器械預期使用的規(guī)定限度下醫(yī)療器械的無致熱性。6.3家兔熱原試驗6.3.1概述家兔熱原試驗是唯一已知的檢測材料介導以及微生物介導的熱原的試驗。9GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021本試驗中高溫浸提物的陽性致熱性表明產(chǎn)品中存在非內(nèi)毒素致熱原。家兔試驗不包括作為常規(guī)質(zhì)量控制試驗的最終產(chǎn)品內(nèi)毒素定量方法。如ISO10993-11所述，含有之前曾引起熱原反應的新物質(zhì)和/或有熱原反應潛力的未知新化學實體的醫(yī)療器械，能評價材料介導的致熱性。6.3.2家兔試驗的原理在靜脈注射醫(yī)療器械或其材料的生理鹽水浸提液后，動態(tài)測量核心體溫，以評價哺乳動物對熱原的體內(nèi)發(fā)熱反應。6.3.3家兔試驗的步驟試驗方案在相關指南和藥典中具有詳細闡述。盡管不同國家的指南/藥典在對家兔體重的限制、基線溫度的測定、樣品溶液的注射劑量和家兔的重復使用方面存在差異，但試驗方案的大部分非常相似。ISO10993-12中還定義了適用于從醫(yī)療器械和材料中制備浸提液的樣品/浸提介質(zhì)比例和浸提條件。值得注意的是，只有無熱原的生理鹽水能作為制備樣品溶液的浸提介質(zhì)。在ISO10993-12規(guī)定的條件中，不會導致材料顯著變化的最高溫度能用于浸提。6.3.4家兔試驗的特點基本上，家兔試驗能檢測出各種熱原，以及發(fā)熱反應的真正效力。這種由每種熱原引起的反應是隨著家兔體內(nèi)核心體溫的升高而估計的。為此，盡管人類和家兔對熱原的種屬特異性不同，家兔體內(nèi)試驗似乎比HCPT有優(yōu)勢。但是，家兔試驗仍存在靈敏度低、使用動物、需要大量試驗樣品等缺點。家兔試驗是唯一已知且經(jīng)過確認用于檢測材料介導的熱原的方法，即從一種引起患者發(fā)熱（發(fā)燒）反應的材料中提取化學可瀝濾物。新的血液接觸或植入材料/器械能篩選材料介導的熱原。然而，在大多數(shù)情況下，家兔試驗并不能代替BET。6.4HCPT6.4.1概述HCPT基于細胞水平的免疫反應，是一種通過激活人免疫細胞如單核細胞和巨噬細胞，來檢測和定量熱原誘導發(fā)熱反應的體外方法。本試驗旨在評價內(nèi)毒素介導的致熱性和由TLR激動劑誘導的致熱反應對應的其他微生物成分介導的致熱性。除了TLR激動劑外，HCPT還能量化由微球和磨損顆粒的吞噬作用引發(fā)的炎癥反應級聯(lián)反應的效力。單核細胞和巨噬細胞是體內(nèi)內(nèi)毒素的主要靶點，迄今已有大量研究利用巨噬細胞來闡明內(nèi)毒素的化學結(jié)構(gòu)和生物活性之間的關系。HCPT的基本技術本身是基于內(nèi)毒素研究的傳統(tǒng)方法。由于該試驗與內(nèi)毒素試驗相比范圍更廣，如果經(jīng)適當?shù)拇_認，它能作為一種有效的方法來彌補內(nèi)毒素試驗與家兔試驗之間差距。6.4.2HCPT的原理巨噬細胞是來源于組織內(nèi)被稱為單核細胞的特定白細胞。單核細胞和巨噬細胞具有吞噬作用，在非特異性防御（或固有免疫）中發(fā)揮作用，并幫助啟動脊椎動物的特定防御機制（或細胞介導免疫）。它們的作用是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬，并通過位于細胞表面的TLR識別可溶性病原體，刺激淋巴細胞和其他免疫細胞對病原體作出反應。作為分泌細胞，單核細胞和巨噬細胞在免疫反應的調(diào)節(jié)和炎癥的發(fā)展中至關重要。這些細胞被吞噬作用或TLR激動劑激活(見4.2和4.3)，產(chǎn)生包括細胞因子在內(nèi)的強大化學物質(zhì)。根據(jù)4.6中描述的機制，細胞因子如TNFα、IL-1β和IL-6作為調(diào)節(jié)因子誘導發(fā)熱反應。在HCPT中，通過ELISA方法檢測和定量這些細胞釋放的細胞因子，作為評價發(fā)熱反應效力的一種方式。6.4.3人類細胞的選擇GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021除了人類全血外，人粒單核細胞細胞系(如MM6)和人單核細胞也可作為HCPT的指示細胞。從實驗室使用的角度來看（供應系統(tǒng)和安全性），這些細胞系可能比全血更有用。然而，全血有以下優(yōu)點：——所有的血液成分都是按生理比例存在，這是熱原與白細胞相互作用所需要的；——浸入全血中是可能的，而這對其他細胞系統(tǒng)來說是不可能的。另一方面，細胞系有以下缺點：——從冷凍樣本開始建立細胞系所花費的時間（通常為數(shù)周）。試驗中需要使用足夠數(shù)量的具有（對熱原）高靈敏度的細胞；——不同傳代數(shù)的細胞之間敏感性不一致；——需要與佛波酯或鈣三醇等藥物共刺激；——需驗證傳導熱原反應所必需的各種受體單元在細胞系上的持續(xù)存在。據(jù)報道，不同細胞系對內(nèi)毒素的敏感性不同。在細胞系中，只有MM6細胞在鈣三醇激活后，針對相對少量的內(nèi)毒素產(chǎn)生大量的TNFα。與這些細胞系相比，全血細胞對內(nèi)毒素具有更高的敏感性，但MM6-CA8細胞（MM6細胞的亞克隆）對檢測內(nèi)毒素和肽聚糖的敏感性與全血細胞幾乎相同。6.4.4細胞因子標志物的選擇雖然TLR激動劑和微球刺激人全血細胞產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子的數(shù)量因刺激劑種類的不同而不同，但在所有情況下，細胞除誘導產(chǎn)生傳統(tǒng)的細胞因子標志物（IL-1β、IL-6和TNFα)外，還會產(chǎn)生大量的MCP-1、IL-1βra、IL-8、MIP-1α和/或MIP-1β。在這些細胞因子和趨化因子中，IL-1β或IL-6因信噪比（S/N）最高而成為較好的標志物。此外，MIP-1α和MCP-1的信噪比相對較高，但MCP-1檢測TLR3激動劑、顆粒和微球的比值相對較低。見參考文獻[35]和[36]。MM6-CA8細胞表現(xiàn)出與全血細胞不同的細胞因子和趨化因子產(chǎn)生模式。除傳統(tǒng)的細胞因子標志物外，還誘導了大量的IL-8、調(diào)節(jié)活化正常T細胞表達和分泌因子（RANTES）、IL-1βra、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β。在這些細胞因子和趨化因子中，IL-6檢測所有TLR激動劑和微球的信噪比最高。MIP-1α、MIP-1β和IL-1β的信噪比也高于TNFα。考慮到這些因素，根據(jù)HCPT中使用的細胞選擇合適的細胞因子標志物或趨化因子標志物。6.4.5HCPT的步驟從健康獻血者抽取的新鮮肝素化人全血或從一批捐贈者中獲取的冷凍保存的人全血，用無熱原的臨床級生理鹽水或RMPI1640培養(yǎng)基稀釋，以直接接觸的方式與器械樣品混合或以間接接觸的方式與樣品浸提液混合。根據(jù)試驗方法的要求，在適合所選培養(yǎng)基的環(huán)境中37℃孵育8h至24h后，用ELISA法測定相應樣品中反應熱原量的細胞因子標志物如IL-1β的量。對于人粒單核細胞系，細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10%熱滅活胎牛血清和適當?shù)难a充劑，如2-巰基乙醇、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2磺酸（HEPES）、谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、牛胰島素和抗生素。細胞由肉豆蔻酸二酚酯或鈣三醇（1a，25-二羥基維生素D3）預孵育。用誘導劑孵育72h后，將細胞以1×106個細胞/mL/孔接種于24孔板上，并置器械樣品（直接法）或取器械浸提出的適量試驗液（間接法）。根據(jù)試驗方法的要求，在適合所選培養(yǎng)基的環(huán)境中37℃孵育8h至24h后，用ELISA法定量細胞釋放到培養(yǎng)基中的細胞因子。MM6（DSMZ；Cat.No.ACC124）是由德國微生物和細胞培養(yǎng)物收藏館（布倫瑞克，德國）提供的 人單核細胞（CTL-MATLLC20521）是由ChagrinBoulevard,ShakerHeights,Cleveland,OH44 品的名稱。給出這一信息是為了方便本文件使用者，并不表示對該產(chǎn)品Kamiyoga,Setagaya-ku,Tokyo158-8501,Japan,haishima@hihs.go.jp提供的產(chǎn)品的名稱。給出這一信息是為了方便本文件使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021ELISA是一種高靈敏和特異性的標準免疫學檢測方法。細胞因子標志物，如試驗樣品中的IL-1β,被夾在單克隆抗體和帶標記的多克隆檢測抗體之間。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合的檢測抗體直接或間接地與辣根過氧化物酶相連，酶代謝底物四甲基苯并胺（TMB）誘導顏色從無色變?yōu)樗{色。加入酸后反應停止，使顏色從藍色變成黃色。在450nm波長處測量光度，參考波長為690nm。每次試驗都要擬合大腸桿菌0111：B4或其他適用標準（如根據(jù)來自E.coliO113:H10的國際世界衛(wèi)生組織參考標準校準的E.coliUKT-B內(nèi)毒素）產(chǎn)生的細胞因子標志物和內(nèi)毒素的劑量反應曲線。該劑量-反應曲線需要包含0.5EU/mL的濃度，相當于世界衛(wèi)生組織參考標準的50pg/mL。該值被認為是引起家兔發(fā)熱的內(nèi)毒素濃度的閾值。2005年用171只家兔的試驗研究證實了這一閾值。在HCPT中，細胞因子標志物是通過刺激試驗樣本中存在的所有熱原來測量免疫細胞釋放的總量。然而，HCPT的結(jié)果是通過將產(chǎn)生的細胞因子標志物的量轉(zhuǎn)化為內(nèi)毒素的量來評價的，因為內(nèi)毒素是最強的熱原，而除內(nèi)毒素外的TLR激動劑誘導的發(fā)熱反應的臨界量目前尚未得到證實。因此，檢測樣品致熱性的概念與BET相同。HCPT具有檢測靶向細胞因子釋放熱原的能力，這是BET所不可能做到的。需要注意的是，除非用醫(yī)療器械浸提液進行確認，否則HCPT檢測不能代替LAL用于大型成批終產(chǎn)品/器械存在細菌內(nèi)毒素污染的常規(guī)質(zhì)量控制檢驗。一般來說，體外HCPT方法需要將一個小塊扁平樣本放在一個小支架中，直接與全血進行試驗。這些方法只檢測非常小面積的材料(如果在24孔板中，則為2cm2或在1.5mL聚丙烯管中進行致熱性測定。也有基于浸提的方法。如果許多器械含有生物來源的成分/組分、含有非注射或吸入的水、器械的生產(chǎn)用水(例如水浸或浸泡、擠壓操作)或用水處理(例如高壓蒸汽、清洗)，則可能發(fā)生細菌內(nèi)毒素污染。對于大批量的最終產(chǎn)品、滅菌產(chǎn)品的常規(guī)質(zhì)量控制，建議進行浸提研究，以確保所有潛在的細菌內(nèi)毒素來源都通過基于內(nèi)毒素的致熱性試驗得到充分檢驗。實際的器械終產(chǎn)品可能非常大，包含非常大的表面積，這可能會導致患者產(chǎn)生材料介導的致熱性(例如：添加劑)。人體血液制品存在特殊危險性，因此所有技術人員都需要進行必要的安全預防措施方面的充分培訓。6.4.6HCPT的特性與家兔試驗和BET相比，HCPT具有以下優(yōu)點?！狧CPT不使用動物。這些細胞來源于人體組織，因此避免了需要跨種屬推斷?！cBET相比，HCPT具有更廣泛的熱原檢測譜?！狧CPT可用于檢測某些無法用家兔試驗或BET進行評價的產(chǎn)品中的熱原污染物。例如：LAL反應的抑制劑和增強劑、影響體溫調(diào)節(jié)的中樞或外周機制并引起家兔免疫反應的藥物）?！狧CPT能夠?qū)⒐腆w材料直接作為試驗樣品進行試驗，而無需任何浸提，因為免疫細胞識別從試驗樣品中洗脫到培養(yǎng)基中以及結(jié)合到其表面的熱原。無需對吸附內(nèi)毒素的材料進行任何預處理即可有效檢測到熱原。HCPT有以下缺點?！牧辖閷У臒嵩镔|(zhì)通常不通過細胞因子網(wǎng)絡來誘導發(fā)熱反應，HCPT很可能檢測不到?！c單核細胞或巨噬細胞相互作用的藥物（如細胞因子受體拮抗劑、非生理溶液、細胞毒性物質(zhì)、具有細胞因子活性的重組蛋白）或檢測體系(例如風濕病因子)，可能不適用HCPT檢測?！狧CPT可能不適用于含有釋放細胞因子和趨化因子的活細胞的組織工程產(chǎn)品?！獧z測時對熱原的反應取決于獻血者的血液樣本或細胞狀況。特別是，由于獻血者的年齡、性別、遺傳背景(例如，TLR細胞因子受體編碼基因的遺傳多態(tài)性)、受感染獻血者的安全問題、晝夜變化、飲食的影響和其他因素的不同，人的血液有所不同，這可能會影響全血體外試驗的敏感性和特異性。——全血供應系統(tǒng)也是個問題。——直接使用固體樣品的HCPT無法用于檢測大型成批終產(chǎn)品、滅菌產(chǎn)品/器械的常規(guī)質(zhì)量控制試驗中是否存在熱原污染?！褂萌肆魏思毎颠M行HCPT預培養(yǎng)和啟動細胞具有時間、成本和技術復雜性等缺點。6.4.7確認研究GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021進一步的確認研究將能夠確定HCPT是否可以檢測通過TLR信號通路和吞噬作用以外的不同機制誘導發(fā)熱反應的其他熱原，包括材料介導的熱原。7結(jié)論在某些情況下，HCPT能夠作為傳統(tǒng)致熱性試驗方法(家兔法和LAL)的有用替代試驗；然而，仍需要家兔試驗來檢測HCPT未檢測到的熱原，包括材料介導的熱原。因此，根據(jù)醫(yī)療器械及其材料的熱原檢測的目的，選擇合適的方法是非常重要的。GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021參考文獻[1]ISO10993-11Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part11:Testsforsystemictoxicity[2]ISO10993-12Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part12:Samplepreparationandreferencematerials[3]ANSI/AAMIST72,Bacterialendotoxins—Testmethods,routinemonitoring,andalternativestobatchtesting[4]UnitedStatesPharmacopeialConvention,availableat:/[5]JapanesePharmacopoeia,availableat:https://www.pmda.go.jp/english/pharmacopoeia/index.html[6]EuropeanPharmacopeia,availableat:http://www.edqm.eu[7]AlganS.M.,PurdonM.,HorowitzS.M.,Roleoftumornecrosisfactoralphainparticulateinducedboneresorption,JOrthopRes,14,pp.30-35,1996[8]AtkinsE.,HuangW.C.,Studiesonthepathogenesisoffeverwithinfluenzalviruses.I.Theappearanceofanendogenouspyrogeninthebloodfollowingintravenousinjectionofvirus,JExpMed,107,pp.383-401,1958[9]AtkinsE.,MorseS.I.,Studiesinstaphylococcalfever.VI.Responsesinducedbycellwallsandvariousfractionsofstaphylococciandtheirproducts,YaleJBiolMed,39,pp.297-311,1967[10]BeesonP.B.,Temperature-elevatingeffectofasubstanceobtainedfrompolymorphonuclearleucocytes(abstract),JClinInvest,27,p524,1948[11]BellonJ.M.,N,G.H.,Jurado,F.,Carranza,A.andBujan,J.,Invitrointeractionofbacteriawithpolypropylene/ePTFEprostheses,Biomaterials,22,pp.2021-2024,2001[12]BencsicsA.,ElenkovI.J.,ViziE.S.,alpha2-,alpha2A-,alpha2B/2C-Adrenoceptorsubtypeantagonistspreventlipopolysaccharide-inducedfeverresponseinrabbits,BrainRes,705,pp.302-306,1995[13]BernatchezS.F.,ParksP.J.,GibbonsD.F.,Interactionofmacrophageswithfibrousmaterialsinvitro.Biomaterials,17,pp.2077-2086,1996[14]BiY.,SeaboldJ.M.,KaarS.G.,RagabA.A.,GoldbergV.M.,AndersonJ.M.,GreenfieldE.M.,Adherentendotoxinonorthopedicwearparticlesstimulatescytokineproductionandosteoclastdifferentiation,JBoneMinerRes,16,pp.2082-2091,2001[15]BodelP.T.,AtkinsE.,Studiesinstaphylococcalfever.V.Staphlococcalfiltratepyrogen,YaleJBiolMed,38,pp.282-298,1965[16]BrandenburgK,HoweJ,GutsmanT,GaridelP.,TheexpressionofendotoxicactivityintheLimulustestascomparedtocytokineproductioninimmunecells,CurrMedChem.,16(21),pp.2653-2660,2009[17]BritoHO.etal.,EvidenceofsubstancePautocrinecircuitrythatinvolvesTNF-“,IL-6,andPGE2inendogenouspyrogen-inducedfever,JournalofNeuroimmunology,293,pp.1-7,2016[18]BraudeA.I.,McC.J.,DouglasH.,Feverfrompathogenicfungi,JClinInvest,39,pp.1266-1276,1960[19]BrunsonK.W.,WatsonD.W.,Pyrogenicspecificityofstreptococcalexotoxins,staphylococcalenterotoxin,andgram-negativeendotoxin,InfectImmun,10,pp.347-351,1974GB/ZXXXXX—ISO/TR21582:2021[20]Bryansetal.,Bacterialendotoxintesting,:Areportonthemethods,background,data,andregulatoryhistoryofextractionreco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