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文檔簡介
HPLC日常維護(三)——流動相HPLC日常維護(三)——流動相1一、液相色譜流動相的性質(zhì)、要求
理想的液相色譜流動相應具有:低粘度與檢測器兼容性好易于得到純品毒性低等特征。
一、液相色譜流動相的性質(zhì)、要求
21.k’值是流動相組成的函數(shù)溶劑強度增加溶質(zhì)在填料表面的吸附減少相應的容量因子k’降低2.塔板數(shù)n一般與流動相的粘度成反比。
注意:1.k’值是流動相組成的函數(shù)注意:3二、流動相選擇原則
①流動相應不改變填料的任何性質(zhì)低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮,從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
二、流動相選擇原則4②純度色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān),特別是當溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時,所用流動相在檢測波長下應沒有吸收,或吸收很小。使用示差折光檢測器時,應選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相,以提高靈敏度。
②純度5④粘度要低(應<2cp)粘度太高時:會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì),降低柱效;還會使柱壓降增加,使分離時間延長;最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
④粘度要低(應<2cp)6三、液相色譜流動相的pH值
1.反相離子抑制技術(shù):采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時,通過調(diào)節(jié)流動相的pH值,以抑制樣品組分的解離,增加組分在固定相上的保留,并改善峰形的技術(shù)。三、液相色譜流動相的pH值
7對于弱酸,流動相的pH值越小,組分的k’值越大;分析弱酸樣品時,通常在流動相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時,通常在流動相中加入少量弱堿,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
減尾劑(除尾劑):流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的相互作用,減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。對于弱酸,流動相的pH值越小,組分的k’值越大;分析弱酸樣品8四、液相色譜流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中,溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。1.正相色譜在正相色譜中,溶劑的強度隨極性的增強而增加;正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。
四、液相色譜流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中,溶劑的洗脫92.反相色譜流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑,再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑,如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下,甲醇-水系統(tǒng)是反相色譜最常用的流動相,具有粘度小、價格低的特點。Snyder推薦采用乙腈-水系統(tǒng)。溶劑強度較高且粘度較小,并可滿足在紫外205nm處檢測的要求,但價格較貴。2.反相色譜103.梯度洗脫技術(shù)在分離含極性差別較大的多組分樣品時,為了使各組分均有合適的k’值并分離良好,也需采用梯度洗脫技術(shù)。
3.梯度洗脫技術(shù)11梯度洗脫(GradientElution)Solventpolarity(composition)continuouslyvariedorstepped梯度洗脫是指在一個分析周期中,按一定的程序連續(xù)改變流動相中溶劑的組成(如溶劑的極性、離子強度、pH值等)和配比,使樣品中的各個組分都能在適宜的條件下得到分離。是分析復雜混合物特別是分離保留性能相差較大的混合物的極為重要的手段。梯度洗脫(GradientElution)12優(yōu)點:改善峰形,提高柱效縮短分析時間強保留成分不易殘留在柱上缺點:會引起基線漂移有時重現(xiàn)性差故需嚴格控制梯度洗脫的實驗條件。優(yōu)點:改善峰形,提高柱效13HPLC流動相的選擇ppt課件14HPLC流動相的選擇ppt課件15五、液相色譜流動相的過濾所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm(或0.22μm)濾過,以除去雜質(zhì)微粒,色譜純試劑也不例外(除非在標簽上標明“已濾過”)。用濾膜過濾時,有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑,過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液,嚴禁用于有機溶劑,否則濾膜會被溶解!溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相,可在混合前分別濾過,如需混合后濾過,首選有機相濾膜?,F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。五、液相色譜流動相的過濾16
六、液相色譜流動相的脫氣
1.脫氣的必要性所用流動相必須預先脫氣,否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡,影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率,影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性,甚至使無法檢測。溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化,對分離或分析結(jié)果帶來誤差。
六、液相色譜流動相的脫氣
1.脫氣的必要性172.溶解氧的危害(1)對紫外檢測器溶解氧能與甲醇、四氫呋喃等形成有紫外吸收的絡合物。此絡合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下),并導致檢測靈敏度的輕微降低;會在梯度淋洗時造成基線漂移。2.溶解氧的危害18(2)對熒光檢測器在熒光檢測中,溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象,特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下,熒光響應可降低達95%。(3)對電化學檢測器在電化學檢測中(特別是還原電化學法),氧的影響更大。
(4)除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能,也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。(2)對熒光檢測器193.脫氣方法
氦氣脫氣法電磁脫氣法超聲波脫氣法超聲脫氣優(yōu)點:10-20分鐘已足夠;不影響溶劑組成。注意:超聲時應避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸,以免玻璃瓶破裂,容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
3.脫氣方法20七、液相色譜流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi),不能貯存在塑料容器中。(許多有機溶劑如甲醇、
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