酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

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ELISA的基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合固相載體表面，并保持活性。②使抗體或抗原與某種酶連接成酶標(biāo)抗體或抗原。③在測(cè)定時(shí)，把受檢抗體（或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同的步驟與固相載體表面的抗原（或抗體）起反應(yīng)。

ELISA的基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合固相載體表面，2④用洗滌的方法去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗原（或抗體），最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。⑤加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物。⑥產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來定性或定量分析。④用洗滌的方法去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗原（或抗體），最后結(jié)合在固相3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ppt課件4

ELISA的類型

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，（3）酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

ELISA的類型

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定5一、雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：1.將抗體包被在固相載體上。

2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。+++固相抗體

標(biāo)本

酶標(biāo)抗體

底物

顯色一、雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操6二、間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法。操作步驟如下：1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。+++固相抗原

標(biāo)本

酶標(biāo)抗體

底物

顯色二、間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法。操作步驟如下7三、酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。1.將抗體包被在固相載體上。

2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原沒有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。

YYY+YYY+YYY參考管酶標(biāo)抗原YYY+YYY+YYY待測(cè)管酶標(biāo)抗原抗原三、酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)8間接ELISA方法的建立1、抗原最佳包被液的選擇；2、抗原、血清和酶標(biāo)二抗工作濃度的確定；3、封閉液的選擇；4、封閉時(shí)間的優(yōu)化；5、血清稀釋液的選擇；6、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化。間接ELISA方法的建立1、抗原最佳包被液的選擇；9ELISA操作步驟以間接ELISA為例：1、包被抗原:用包被液將抗原稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃過夜；2、洗滌:棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3min，最后用吸水紙拍干；ELISA操作步驟103、封閉：各孔加入封閉液200ul，37℃作用1h；4、洗滌；5、加被檢血清：將血清樣品稀釋至最佳濃度，每孔100μL，每個(gè)樣本兩孔，每塊板同時(shí)設(shè)陰性、陽性及空白對(duì)照各兩孔，37℃作用30min；6、洗滌；3、封閉：各孔加入封閉液200ul，37℃作用1h；117、

酶標(biāo)二抗：稀釋HRP標(biāo)記羊抗豬IgG，每孔100μL，37℃作用30min；8、洗滌；9、顯色：加新鮮配制的TMB底物液每孔100μL，室溫避光作用15min；10、加終止液：加50μL

2mol/L硫酸；11、讀數(shù)：用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。7、

酶標(biāo)二抗：稀釋HRP標(biāo)記羊抗豬IgG，每孔100μL，12血清學(xué)方法有很多種,如傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散(AGID)、血凝抑制(HA/HI)、乳膠凝集、試管凝集、補(bǔ)體結(jié)合等方法，但這些方法不是最合適的檢測(cè)方法。EILSA技術(shù)與其有著不同的特點(diǎn)：1、靈敏度高。ELISA是通過酶促反應(yīng)放大檢測(cè)信號(hào),從而提高檢測(cè)的靈敏度,其檢測(cè)限可達(dá)ng甚至pg水平,可做定量測(cè)定。2、特異性強(qiáng)。ELISA的每一步體的特異性識(shí)別過程,結(jié)構(gòu)類似物、有色物質(zhì)、熒光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)的影響很小。3、樣品的預(yù)處理過程和ELISA的操作步驟簡(jiǎn)單快捷，有的試劑盒僅需1~2個(gè)小時(shí)即可得出檢測(cè)結(jié)果，并且可同時(shí)檢測(cè)數(shù)十甚至上百個(gè)樣品。4、設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于基層。ELISA的優(yōu)點(diǎn)：ELISA的優(yōu)點(diǎn)：13

ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也