控制菌及螨類檢查技術(shù)-藥品中大腸菌群檢查

項目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)5藥品中大腸菌群檢查知識點5藥品中大腸菌群檢查方法5.1大腸菌群大腸菌群(Coliform)是指37℃生長時能發(fā)酵乳糖，在2h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。符合上述定義的細菌除大腸埃希菌屬(

Escherichia)的多數(shù)菌外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬(

Enterobacter)、枸櫞酸菌屬(

Citrobacter)、克雷伯菌屬(Ablh)的多數(shù)菌。大腸菌群包括了正常人畜腸道內(nèi)需氧的大多數(shù)革蘭陰性桿菌。以大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌比控制大腸埃希菌具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，檢查方法簡便。因此，國際上以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生指示菌，對衛(wèi)生質(zhì)量的要求更嚴(yán)格。藥品中大腸菌群檢查方法大腸菌群細菌在水、土壤、空氣中常見，它是人和動物腸道中主要的菌叢，常通過糞便和動物的活動污染水和環(huán)境，同時也帶來致病污染的危險。有人用糞便污染土壤后，在不同時間(1～2個月)檢查土壤中大腸埃希菌的存活情況。結(jié)果隨著時間的增加，大腸埃希菌的存活率降低，而產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌的檢出率逐漸增加。說明大多數(shù)大腸埃希菌不能適應(yīng)外界環(huán)境而死亡，少部分大腸埃希菌在外界環(huán)境的影響下逐漸變成的產(chǎn)氣腸桿菌或陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌。由此表明：在樣本中檢出大腸埃希菌，表明樣本受糞便的近期污染；如同時檢出產(chǎn)氣腸桿菌或陰溝腸桿菌、肺炎克雷菌，表明樣本受糞便的近期污染和遠期污染。大腸菌群的檢查通過增菌、分離、革蘭染色鏡檢和確證試驗等步驟。藥品中大腸菌群檢查方法5.2檢查程序5.2.1增菌培養(yǎng)

取不少于10m膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，加入1:10供試液1ml(含供試品0.1g或0.1ml);1:100稀釋的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)和1:1000稀釋的供試液1ml(含供試品0.001g或0.001ml)。取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基10ml管，加入稀釋劑1ml作為陰性對照。均培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。加供試液的膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長，或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判該管未檢出大腸菌群。若膽鹽乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則進一步分離培養(yǎng)。5.2.2分離培養(yǎng)

將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24h。藥品中大腸菌群檢查方法大腸菌群的菌落在紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基平板上呈紫黑、紫紅，紅或粉紅色，圓形，偏平或凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤：在麥康圓瓊脂培養(yǎng)基平板上呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，若平板上無菌落生長，或生長的菌落與上述菌落特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群：若平板上生長有上述菌落形態(tài)特征或疑似菌落，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進行確證試驗。5.2.3確證試驗

從上述分離平板上挑選4～5個疑似菌落，接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24-48h、若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸需群，否則判未檢出大腸菌群（見下表）。藥品中大腸菌群檢查方法最可能的大腸菌群數(shù)藥品中大腸菌群檢查方法各供試品量的檢出結(jié)果最可能的大腸菌群數(shù)1.0g或1.0ml0.1g或.0.1ml0.01g或0.01ml+++﹥102++-10﹤N﹤102+--1﹤N﹤10---﹤15.3注意事項5.3.1加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，由于有的藥渣顏色較深或沉淀物較多，干擾結(jié)果的觀察。應(yīng)仔細觀察倒管底部或試管壁、培養(yǎng)液表面有無氣泡。5.3.2乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的倒管不小于30mmx3mm(內(nèi)徑)。否則，倒管被藥渣遮擋，不便觀察結(jié)果。5.3.3加供試液的乳糖膽鹽發(fā)醇管，經(jīng)培養(yǎng)后，其倒管內(nèi)無論產(chǎn)氣多少，均應(yīng)做分離培養(yǎng)，革蘭染色、鏡檢。如產(chǎn)氣太少，可延長培養(yǎng)時間。5.3.4盡可能多挑選EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上大腸菌群可疑菌落，做乳糖發(fā)酵確證試驗。挑可疑菌落越多，可提高大腸菌群檢出率。藥品中大腸菌群檢查方法項目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)5藥品中大腸菌群檢查技能點2藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程1.實訓(xùn)目的掌握大腸菌群的檢查程序及注意事項。2.實訓(xùn)要求2.1能按照下達的任務(wù)要求，完成大腸菌群檢查的試驗設(shè)計。2.2能根據(jù)試驗設(shè)計完成試驗的準(zhǔn)備及試驗的具體操作。2.3能根據(jù)試驗反應(yīng)的結(jié)果做出正確的結(jié)論。3.實驗原理一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人、畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷產(chǎn)品中有否有污染腸道致病菌的可能。藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程4.儀器及設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、玻璃平板或一次性無菌平板、多頭濾器及配套設(shè)施、濾膜（0.45μm）、鑷子、高壓滅菌鍋、牛皮紙、棉繩、橡皮筋、冰箱

、塑料瓶、酒精燈、

三角瓶、橡皮塞、超凈工作臺、取樣袋、75%酒精、無菌蒸餾水5.培養(yǎng)基和試劑5.1培養(yǎng)基：大腸菌群顯色培養(yǎng)基制備：根據(jù)供應(yīng)商提供的說明書，攪拌加熱煮沸至完全溶解，不要高壓蒸汽滅菌，不要過度加熱。待培養(yǎng)基冷卻至47±2℃，分裝至平板，厚度為4mm。倒置冰箱保存。5.2氧化酶試紙5.3酵母浸膏培養(yǎng)基（無葡萄糖PCA）或胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.操作步驟:6.1過濾及培養(yǎng)6.1.1灼燒過濾頭除菌，使用無菌鑷子將濾膜貼放于已冷卻的過濾頭上，安裝濾杯。在CCA平板上記錄相關(guān)信息。6.1.2過濾前充分搖晃，混勻待測樣品，將待測樣品倒入濾杯中。6.1.3

使用無菌鑷子小心轉(zhuǎn)移濾膜至CCA培養(yǎng)基，無菌操作。6.1.4將平板倒置于36±2℃培養(yǎng)21-24小時藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.2結(jié)果判讀6.2.1分別計數(shù)不同類型的菌落，根據(jù)下表對菌落進行驗證：

注：NA表示不適用藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程CCA瓊脂上的菌落類型氧化酶試驗紫羅蘭色菌落NA粉紅色菌落√其他類型菌落NA(1)所有紫羅蘭色菌落均確認為大腸埃希氏菌，不需要進行氧化酶試驗。(2)部分CCA平板上可能出現(xiàn)藍綠色菌落，這部分菌落不應(yīng)該記錄為大腸菌群或大腸桿菌。(3)對粉紅色的菌落，證實試驗是必須的。

6.3驗證試驗6.3.1氧化酶試驗挑取至少10個菌落進行該試驗(如果總的粉紅色菌落少于10個,則應(yīng)挑取全部菌落進行試驗),可直接挑取CCA平板上的菌落進行氧化酶測試,但務(wù)必注意,粉紅色菌落本身帶有顏色,淺紅色或無色均被認為是陰性結(jié)果。紫紅色才被認為是陽性結(jié)果。禁止使用鐵質(zhì)或鎳鉻絲接種環(huán)。藥品中大腸菌群檢查試驗操作規(guī)程6.4分離純化試驗6.4.1TSA劃線如果由于菌落太小，或者菌落之間太近存在融合，則使用接種環(huán)小心挑取部分菌落，劃線接種在TSA培養(yǎng)基上。倒置于36±2℃培養(yǎng)22±2H，然后再挑取單菌落進行氧化酶試驗。7.結(jié)果報告大腸菌群的結(jié)果=（紫羅蘭色的菌落數(shù)+確認為