耐亞胺培南弗勞地枸酸桿菌的耐藥機制研究

耐亞胺培南弗勞地枸酸桿菌的耐藥機制研究

枸杞酸菌是人類腸道的正常菌群。廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境中。這是一種條件下的致病性，通常導致腹瀉、出血、尿道感染和呼吸道感染。盡管弗勞地枸櫞酸桿菌在臨床上的檢出率并不是很高,但近年來對抗菌藥物的耐藥性不斷增加,多重耐藥菌株常有出現(xiàn),甚至出現(xiàn)了亞胺培南耐藥株11.1患者分離的弗勞地枸杞酸桿菌臨床菌株:弗勞地枸櫞酸桿菌NC118于2009年4月分離自南昌大學第二附屬醫(yī)院一患者的痰液標本。患者,男,23歲,于2009年4月23日因急性淋巴細胞白血病發(fā)熱20余天入住該院血液內(nèi)科,2009年4月29日患者因呼吸道感染咳嗽、咳痰而做痰液培養(yǎng),分離到1株耐亞胺培南的弗勞地枸櫞酸桿菌,5月4日患者因大量咯血搶救無效死亡。參考菌株大腸埃希菌V517(1.2試驗和成像儀Vitek-32全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司產(chǎn)品)、PCR儀(Ependoff公司產(chǎn)品)、電泳儀(Bio-rad公司產(chǎn)品)和凝膠成像儀(上海天能公司產(chǎn)品)。1.3試劑Taq酶、10×Buffer、dNTP、MgCl1.4藥敏紙片的制備Etest條購自瑞典ABBiodisk公司。藥敏紙片:頭孢噻肟(CTX,30μg)、頭孢噻肟/棒酸(CTX/CA,30μg/10μg)、頭孢他啶(CAZ,30μg)、頭孢他啶/棒酸(CAZ/CA30μg/10μg)(北京天壇生物技術(shù)公司產(chǎn))。其余藥敏紙片均為Oxiod公司。亞胺培南粉劑購自杭州默沙東公司。1.5引用產(chǎn)品碳青霉烯酶基因及AmpC酶基因引物序列參照文獻1.6細菌的鑒定弗勞地枸櫞酸桿菌NC118經(jīng)革蘭染色和氧化酶試驗初篩,再經(jīng)Vitek-32全自動微生物分析儀及API鑒定為弗勞地枸櫞酸桿菌。1.7藥物過敏試驗和mic值的測定被測菌株MIC值采用Etest法,以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株,結(jié)果判斷按照CLSI標準進行1.8美羅培南紙片接種法將大腸埃希菌ATCC25922調(diào)至菌液濃度為0.5麥氏單位,常規(guī)涂布M-H平皿,使平皿干燥3～10min,取美羅培南紙片(10μg/片)置于平皿中心,用接種環(huán)挑取在血瓊脂平皿過夜生長的3～5待測菌落,從美羅培南紙片邊緣向外劃直線接種。劃線至少要20～25mm長。(35±2)℃,空氣環(huán)境,孵育16～20h,觀察結(jié)果,在抑菌環(huán)與待測菌株劃線交叉處出現(xiàn)增強生長為碳青霉烯酶陽性。1.9金屬酶初步篩選試驗采用協(xié)同法,使用CAZ和加0.1mmol/LEDTA的空白紙片進行金屬酶篩選,操作和結(jié)果判斷標準參照文獻1.10通過制備氨基丙烯酸酶粗提酶液和頭孢西丁三維試驗按超聲波破碎法制備細菌粗提酶液,頭孢西丁三維試驗參照文獻1.11桿菌菌落加入雙蒸水采用煮沸法,吸取250μl雙蒸水,挑取血平板過夜培養(yǎng)的弗勞地枸櫞酸桿菌菌落2～3個,加入雙蒸水中?；靹蚝蠹訜嶂蠓?5min,以15000r/min的速度在低溫高速離心機中離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移到一干凈的無菌微量離心管中,即為細菌總DNA溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?.12dntp-pcr反應PCR反應總體積為50μl,其中引物各500nmol/L,10×PCR緩沖液5μl,dNTP(200μmol/L),鎂離子2.5mmol/L,Taq酶2.0U,DNA模板5μl,雙蒸水補足50μl。擴增條件為:95℃初變性5min,然后95℃變性1min,退火溫度根據(jù)文獻進行1.13測序過程所有PCR陽性產(chǎn)物送上海桑尼公司進行直接測序,DNA序列利用NCBI網(wǎng)站(/)的BlastN程序進行比對確定基因型。1.14供體菌和受體菌的接種為了了解碳青霉烯酶基因是否可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,以大腸埃希菌J53作為受體菌進行接合試驗。把對數(shù)生長期的供體菌及受體菌各0.5ml接種到4ml新鮮LB肉湯中過夜培養(yǎng)。接合子以胰大豆瓊脂(TSA)平皿篩選,平皿中含疊氮化合物(100mg/L)、亞胺培南(1.5mg/L)進行。22.1藥物過敏結(jié)果及mic值的測量弗勞地枸櫞酸桿菌NC118對所測抗生素全部耐藥,藥敏結(jié)果見表1。2.2pepopol-xiushi三維試驗三維試驗陽性,即AmpC陽性。2.3金屬酶初步篩選與碳青霉酶基因檢測弗勞地枸櫞酸桿菌NC118金屬酶初篩結(jié)果為陰性,經(jīng)PCR檢測,2.4酶基因檢測氨基闡明經(jīng)多重PCR檢測CIT型特異性引物PCR擴增陽性,其余為陰性。經(jīng)DNA測序和BlastN程序比對為2.5試驗結(jié)論經(jīng)反復試驗,沒有獲得接合子,耐藥基因位于非接合性的質(zhì)粒上。3碳青霉烯類藥物在所有β-內(nèi)酰胺類抗生素中,碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣、抗菌活性最強的抗生素,臨床常用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶菌感染的治療。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用,臨床已出現(xiàn)了耐藥株,尤以銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌多見,且主要局限在非發(fā)酵菌中,腸桿菌科中很少見,但近幾年己有