多重耐藥肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的檢測

多重耐藥肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的檢測

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院最重要的感染條件之一，可引起典型的核電站肺炎和肺外感染。這種菌容易產(chǎn)生超廣的內(nèi)酰胺酶，并可能含有少量抗癲癇藥物，這對細(xì)菌的抗劑性傳播起到了重要作用。1材料和方法1.1耐藥肺炎克雷伯菌的鑒定實(shí)驗(yàn)菌株為本院從2007年1月至2012年12月臨床分離的151株多重耐藥的肺炎克雷伯菌,細(xì)菌耐藥性及鑒定均經(jīng)過VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)分析鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922,金屬酶陽性菌株RP01和Hodge試驗(yàn)陽性菌株KP1為實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。1.2膠片和空白紙片DNAMarker和PCR配套試劑購自Takara公司,瓊脂糖和溴化乙錠購自北京鼎國公司,引物由上海英濰捷基公司合成;藥敏紙片亞胺培南紙片IPM、厄他培南紙片ETP和空白紙片購自O(shè)xoid公司;M-H瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基均購自梅里埃微生物制品有限公司;1.3碳青霉烯酶檢測將大腸埃希菌ATCC25922和24h血平板上的單個菌落分別制備菌懸液,比濁至0.5號麥?zhǔn)瞎?再用生理鹽水把已配好的大腸埃希菌的菌懸液稀釋10倍,用無菌拭子浸入菌懸液中,在管壁上擠干,均勻涂于整個M-H平板表面,中間貼厄他培南ETP紙片,每個M-H平板接種4株菌株,并做好陰性對照(大腸埃希菌ATCC25922)和陽性對照(產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌KP1),無菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣畫線,35℃孵育16~18h后觀察結(jié)果,結(jié)果判斷:ETP紙片抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。1.4平等整合藥敏膠片取MHT實(shí)驗(yàn)中已比濁好的待測菌的菌懸液,用無菌拭子浸入菌懸液中,在管壁上擠干,分別均勻涂于整個M-H平板表面,在平板的一端貼亞胺培南(IPM,10μg)藥敏紙片,在距紙片2cm處貼一空白紙片,并在空白紙片上面加入4μL0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液,再在距離IPM紙片4cm處另貼一IPM紙片,再滴加4μL0.5mmol/LEDTA溶液,35℃培養(yǎng)過夜。結(jié)果判斷:IPM紙片抑菌圈在靠近滴加EDTA空白紙片抑菌圈有明顯擴(kuò)大者或滴加EDTA的IPM紙片的抑菌環(huán)直徑大于4mm則為產(chǎn)金屬酶株。1.5pcr和dna測試序列按照文獻(xiàn)2結(jié)果2.1耐藥率和藥敏率151株肺炎克雷伯菌的藥敏情況見表1。共有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)陽性菌93株,ESBL陰性菌58株,產(chǎn)ESBL的陽性率為62%。藥敏分析表明,產(chǎn)ES-BL株對青霉素類、第一和第三代頭孢菌素類高度耐藥,耐藥率均高于90%(第三代頭孢替坦除外,為19%),但對第四代頭孢耐藥率為77%;對單環(huán)類的氨曲南耐藥率高達(dá)100%,而對喹諾酮類、磺胺類藥物耐藥性也較高,為70%左右;對加酶抑制劑復(fù)合藥氨芐西林/舒巴坦的耐藥率也高達(dá)94%,而對頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為37%和30%;產(chǎn)ESBL對亞胺培南高度敏感,敏感度為99%,對厄他培南的敏感率為78%。在2009~2012年收集到的71株菌中,產(chǎn)ESBL株有47株,美洛培南的敏感率為87%,非產(chǎn)ESBL株有24株,美羅培南的敏感率為96%。本研究顯示,除厄他培南、亞胺培南、美羅培南和左旋氧氟沙星外,產(chǎn)ESBL株均比非產(chǎn)ESBL株的耐藥性高。2.2碳青霉烯酶菌株在151株肺炎克雷伯菌中,Hodge試驗(yàn)陽性的有12株,占7.9%,這些菌株可能產(chǎn)碳青霉烯酶;陰性的有139株,占92%,陰陽性對照見圖1,且在該12株菌中,雙紙片協(xié)同試驗(yàn)和組合紙片法同時為陽性的細(xì)菌有1株,說明該菌株可能產(chǎn)金屬酶。2.3pcr電泳結(jié)果12株Hodge試驗(yàn)陽性結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增后有5株確證為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株,其中有4株為KPC型,其陽性率為2.6%,1株為IMP型,陽性率為0.7%。該5株菌的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1和圖2。PCR產(chǎn)物測序的結(jié)果表明,4株產(chǎn)KPC型菌株均攜帶KPC-2基因亞型,而1株產(chǎn)IMP型菌株攜帶IMP-4基因亞型。3kpc酶和耐藥金屬酶的關(guān)系近年來由于抗菌藥物的濫用,尤其是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,以致產(chǎn)ESBL的肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物的耐藥性上升,如碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上使用的增加,對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株被越來越多的報道。碳青霉烯類藥物對質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBL、染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶(AmpC)高度穩(wěn)定,但其也可被金屬β-內(nèi)酰胺酶水解滅活,造成碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。而本研究的藥敏結(jié)果顯示,經(jīng)PCR確證試驗(yàn)為產(chǎn)碳青霉烯酶的5株菌中,4株KPC型的厄他培南、亞胺培南和美洛培南的耐藥率均為100%,其ESBL也均為陽性,而1株IMP型的厄他培南、亞胺培南和美洛培南的敏感率均為100%,且ESBL為陰性,這5株菌對其他常用抗菌藥物均高度耐藥,由資料可推測,產(chǎn)KPC酶可能是本院的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制,文獻(xiàn)報道KPC-2型的肺炎克雷伯菌在我國