DIG試劑盒說明書(CSPD)中文翻譯版講解

#只用于生命科學研究，不能用于診斷程序僅用于體外實驗DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit采用地高辛-dUTP進行隨機引物DNA標記，堿性標記，利用CSPD化學發(fā)光檢測，隨時即用。貨號：11585614910此試劑盒儲存條件：-15C到-25C。此試劑盒可對10ng-3“gDNA進行12次標記反應，可檢測10x10cm2面積的雜交膜24張。指導手冊2005.12版1前言1.1內(nèi)容表1前言1.1內(nèi)容表1.2試劑盒成分介紹2.1產(chǎn)品簡介操作步驟和所需材料3.1在你開始前3.2流程圖3.3地高辛標記DNA標記效率的確定DNA的轉移和固定雜交免疫檢測DNA印記的洗脫和再雜交附錄故障排除參考文獻訂購信息1.2試劑盒的成分瓶號標記內(nèi)容包括功能1DIG-高效引物50mL地咼辛標記的咼效引物5X濃度的標記混合物:優(yōu)化的濃度的隨機引物，核昔酸，地高辛標記的dUTP（堿標記的），Klenow酶和緩沖液成分隨時可用澄清的粘液用于DNA的高效隨機引物標記

2DIG標記的對照DNA20uL5卩g/mL質粒pBR328DNA（用BamHI線性化）澄清溶液用于確定標記效率3DNA稀釋緩沖液3管1mL50卩g/mL魚精DNA,10mMTris-HCl,lmMEDTA,pH8.0在25°C澄清溶液4抗地高辛的堿性磷酸酶結合物50uL750U/mL從羊中獲取的，F(xiàn)ab段，結合堿性磷酸酶澄清溶液5CSPD隨時可用50mLCSPD澄清溶液6封閉液4X100mL

10X濃度黃色，粘液7地高辛雜交顆粒100mL地高辛雜交液共4瓶，用于DNA雜交附加儀器與所需試劑除了上表中列出的試劑外，你必須準備一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要準備的設備概要。在每個操作程序的前面提供了詳細的信息操作程序儀器設備試劑3.3DIG-DNA標記水浴滅菌的雙蒸水0.2MpH8.0滅菌的EDTA3.4標記效率的半定量帶正電荷的尼龍膜*地高辛洗滌和封阻緩沖組合*或者洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液

3.5DNA轉移和固定紫外光盒或者商業(yè)化可用于紫外交聯(lián)的其他設備20XSSC或者10XSSC3.6雜交尼龍膜，帶正電荷*雜交袋*,或者耐熱的塑料袋或者滾筒瓶注意：當用地高辛雜交緩沖液工作時，不要用開口的托盤。3.7免疫檢測耐熱的塑料袋或者滾筒瓶雜交袋*地高辛洗滌和封阻緩沖液組合*，或者洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液3.8DNA斑點的脫色和重新標記探針大的托盤水浴10XSSC10%SDS0.2MNaOH

*標記的產(chǎn)品可以從RocheAppliedScience獲得。2.介紹2.1產(chǎn)品概況實驗原則此試劑盒采用DIG（地高辛），一種甾類半抗原，steroidhapten去標記DNA探針用于雜交和后續(xù)的免疫檢測［1,2,3］。步驟描述DNA標記根據(jù)隨機引物標記技術采用地高辛標記引物獲得了地高辛標記的DNA探針。地咼辛標記的咼效引物是一種專門生產(chǎn)的反應混合物，其中含有地咼辛dUTP，堿性標記（圖1）和所有的試劑，包括隨機引物標記所必須的酶，已預先混合優(yōu)化的5X濃度反應緩沖液。雜交根據(jù)標準方法，地高辛標記的探針可以與固定在膜上的核酸雜交。采用堿標記形式的地咼辛11dUTP能夠更加容易和有效的被洗脫下來，使固定在膜上的核酸可以與其他的地高辛標記探針再次雜交。免疫檢測雜交探針可以用抗地高辛的堿性磷酸酶進行免疫檢測，F(xiàn)ab段，然后采用即時可用的化學發(fā)光底物CSPD可以看到雜交結果。采用堿性磷酸酶可以對CSPD進仃，酶的脫磷酸化，導致在取大波長477nm處有光的發(fā)射（圖2）,這一現(xiàn)象可以用適合的圖像儀或者X光片進行記錄。膠片的曝光時間范圍只在5-30分鐘內(nèi)。圖1DIG-dUTP，堿性標記圖2CSPD反應應用地高辛標記DNA探針可以用于：所有類型的濾膜雜交總基因組DNA中單拷貝基因的檢測，甚至對于高度復雜的生物體也可以進行檢測，如人，大麥和小麥。樣品材料至少100bp的DNA片段線性的質粒，cos質?；蛘逥NA超螺旋的DNA實驗時間此表格列出了每一步實驗所需的反應時間。步驟反應時間DNA標記1小時-過夜雜交6小時或者過夜免疫檢測1.5小時測化學熒光信號檢5-30分鐘檢測數(shù)量一個試劑盒足夠用于:12個標準的標記反應，每個反應的膜板DNA不超過3ug；并可以檢測24張10X10cm2的雜交膜。質量控制根據(jù)操作步驟中的說明對未標記的對照DNApBR328進行標記，

并按照下面的標準檢測操作方法在點雜交中用50ng的異源的DNA稀

釋0.1pg同源DNA，用即時可用的CSPD,X光片曝光30分鐘進行檢測。試劑盒的儲存和穩(wěn)定性未開封的試劑盒在保質期內(nèi)可以穩(wěn)定的存放在T5°C到-25°C（保質期印在標簽上）。在干冰中運輸。一旦開封，請根據(jù)下表選擇適宜的儲存條件。試劑盒成分儲存條件抗地高辛堿性磷酸酶結合物（4號管）2-8C穩(wěn)定。注意：不要凍存

CSPD隨時即用（5號管）2-8°C，避光保存。圭寸阻液（6號管）未開封時15C25C穩(wěn)定。旦開封，應分裝并儲存在-15C到-25C或者無菌條件下2-8C間可以穩(wěn)定保存1個月。工作溶液都應是新鮮配制的。地高辛雜交顆粒儲存在15C-25C旦開封，無菌條件下溶液可以穩(wěn)定存在1個月。地高辛高效引物混合物保質期12個月，-15C到-25C。避免反復凍融。靈敏度和特異性采用southern雜交從0.3ug人胎盤DNA（經(jīng)BglII或EcoRI酶切）中檢測到單拷貝基因（組織纖溶酶原激活因子tPA）。優(yōu)點此表描述了這個試劑盒的優(yōu)點和特征優(yōu)點特征精確、快速預先已混好的地高辛高效引物混合物減少了標記DNA時手動操作的時間，同時提高了產(chǎn)量，重復性好靈敏在復雜的總人DNA及植物基因組中能夠檢測到單拷貝基因。

省時地咼辛標記的探針可以至少儲存一年。雜父溶液可以重復利用3-5次，重復次數(shù)主要取決于每次雜交中產(chǎn)生信號的標記探針的量。3．實驗步驟和所需材料在你開始前主要的操作要求此表中描述了地高辛標記和檢測中主要的提示：要求指引在清潔的條件下進行操作咼壓滅菌地咼辛系統(tǒng)的試劑過濾滅菌的溶液包括：SDS,吐溫20,并應該加入到已滅菌的溶液中。用干凈的孵育托盤每次使用前都要嚴格地清洗實驗托盤處理膜的要求帶無粉手套處理膜的時候，只能夠用干凈的鑷子夾膜的邊緣流程圖

3.3部分地高辛標記DNA3.4部分標記效率的檢測3.5部分DNA固定3.6部分雜交3.7部分免疫檢測3.8部分洗脫和DNA斑點與另一探針的雜交地高辛標記DNA介紹隨機引物標記的DNA帶有地高辛-11-dUTP,這一標記采用的是地高辛高效引物試劑，這是一種含有隨機六碳糖，dNTP混合物的5X濃度標記混合物，其中dNTP混合物包括堿性標記的地高辛-11-dUTP,

標記級的Klenow酶和適合的反應緩沖液。附加設備和所需試劑此表中列出了成分，儲存條件和除了試劑盒成分外所需試劑的用途。溶液成分儲存條件/穩(wěn)定性用途水咼壓滅菌的雙蒸水15-25°C，穩(wěn)定稀釋DNAEDTA（乙二胺四乙酸）0.2MEDTA,pH8.015-25°C，穩(wěn)定終止標記反應模板DNA下表中列出了模板DNA所需特征:特征詳細信息純度模板DNA應該采用theHighPurePlasmidIsolationKit進行制備。當采用其他商業(yè)化的純化試劑盒進行純化時，我們建議額外進行次苯酚/氯仿抽提以去除殘余的蛋白質。

在標記之前如果對模板進行限制酶切或者其他酶的修飾作用，那么此步驟也是需要進行的。大小為了獲得理想的結果，模板DNA應該線性化，且大小應該在100bp以上。如果模板DNA大于5kb，那么在標記之前應該采用限制性酶切序列為4個核苷酸的限制性酶（如HaeIII）對模板進行酶解。數(shù)量上面步驟描述原則上10ng-3ug的模板均可以標記上，然而請仔細查看在給定的表中，用于你的雜交實驗所需的探針?？梢愿鶕?jù)提供的操作方法放大總體積和成分用量來獲得更大量的標記探針。如果要檢測復雜基因組中的單拷貝基因，需標記的模板DNA用量至少300ng（探針濃度：25ng/mL雜交液）。標記從瓊脂糖凝膠上分離的DNA如果你想要完成基因組的southern雜交，你應該利用瓊脂糖凝膠電泳將插入載體的模板DNA從載體上分離出來。為了從凝膠中分離DNA，你可以用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒（theAgaroseGelDNAExtractionKit）進行大小在400bp-5kbp范圍內(nèi)DNA片段的回收。這一試劑盒既可以用于標準瓊脂糖凝膠也可用于低熔點瓊脂糖凝膠。然后，不需要進一步純化即可對DNA片段進行高效的地高辛標記然后標記好的探針應該用高效的PCR產(chǎn)物純化

試劑盒（HighPurePCRProductPurificationKit）進行純化以去除殘留的瓊脂糖顆粒。步驟此步驟用于標記10ng-3ugDNA?？梢酝ㄟ^擴大所有成分和體積標記更大量的DNA（最高達10ug）。步驟操作1向一個反應管仲中加入lug模板DNA（線性或超螺旋）和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達16uL。2沸水浴10分鐘以變性DNA,然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全變性對于標記的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-HighPrime（1號管），并取4uL加入到變性DNA中，混合并簡單離心。37°C孵育1小時或者過夜。注意：較長的孵育時間（最高達20小時）能夠提高地高辛標記DNA的產(chǎn)量（見下表）4加入2uL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65C加熱10分鐘終止反應。

注意：采用地咼辛咼效引物獲得的地咼辛標記片段的長度范圍可以從200bp到1000bp甚至更長，這主要取決于原始模板DNA的長度。標記反應的產(chǎn)量表1：此表向您展示了在適宜條件下地高辛高效引物標記的產(chǎn)量。在標準反應中每個實驗采用lugDNA作為模板。1小時內(nèi)，大約有15%的核苷酸參與到了0.8ug新合成的地高辛標記DNA中。20小時后消耗了大約38%的核苷酸。模板DNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量進行反應，并檢測反應1小時和反應20小時的差異。地高辛標記DNA的產(chǎn)量由放射線示蹤器進行測定，并通過斑點雜交進行證實（10個獨立標記實驗的平均值）。圖3來自于不同量模板DNA的地高辛標記DNA在37°C孵育1小時和20小時后的產(chǎn)量標記效率的確定介紹地高辛標記DNA產(chǎn)量的確定對于獲得最佳的，具有可重現(xiàn)性的雜交結果十分重要。在雜交混合物中探針濃度過高容易產(chǎn)生背景，而太低濃度則容易導致信號弱。實驗原則檢測標記探針質量的好方法是直接檢測法。步驟描述1將地高辛標記DNA的一系列稀釋梯度點到一小塊帶正電荷的尼龍膜上。尼龍膜部分區(qū)域已經(jīng)點好一系列稀釋梯度的地高辛標記的對照DNA（2號管）作為標準。2采用anti-DIG-AP結合物（4號管）和隨時即用的CSPD對尼龍膜進行免疫檢測。所需附加溶液的制備

請找出下表中的成分和所需制備的試劑。下表中的緩沖液也可以在地高辛洗滌和封阻緩沖液無DNA酶和RNA酶系列產(chǎn)品中獲得。請注意：標記效率確定實驗中檢測部分所需的試劑和工作試劑應與你的雜交實驗（請看3.7章）中化學發(fā)光檢測使用的試劑一致。這些試劑可以大量制備，在第3.7章中也將用到。溶液成分/制備儲存/穩(wěn)定性用途洗滌緩沖液0.1M馬來酸0.15MNaClpH7.5(20°C)0.3%(v/v)Tween2015-25C，穩(wěn)定去除未結合的抗體馬來酸緩沖液0.1M馬來酸0.15MNaCl用NaOH(固體)調(diào)節(jié)pH值到7.5(20C)15-25C，穩(wěn)定封阻液的稀釋檢測緩沖液0.1MTris-HCl0.1MNaClpH9.5(20C)15-25C，穩(wěn)定調(diào)整pH值到9.5

試劑盒工作溶液的制備下表中列出試劑盒工作溶液的制備方法溶液成分/制備方法儲存/穩(wěn)定性用途封阻溶液用馬來酸緩沖液按照1:10的比例將10X封阻液（6號管）稀釋成IX工作溶液一直新鮮制備封阻膜上非特異結合位占抗體溶液每次使用前將原始管仲的anti-digoxigenin-AP（4號管）10000rpm離心5分鐘。然后從表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀釋anti-digoxigenin-AP2-8°C,12h與地高辛標記的探針結合稀釋系列根據(jù)合成核苷酸的預期產(chǎn)量開始下面的的系列稀釋，標記的探針和地高辛標記的對照DNA（2號管）應該稀釋到Ing/uL。利用第3.3章中圖表可以最好的估計出在你的探針中地高辛標記DNA的預期產(chǎn)量。產(chǎn)量取決于起始時的模板量和孵育時間。注意：表1中給出的