PCR技術(shù)及其應(yīng)用課件

第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用1ppt課件.第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用1ppt課件.PCR技術(shù)的建立Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想—“修復(fù)復(fù)制”但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……2ppt課件.PCR技術(shù)的建立Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DN1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)Mullis的構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段3ppt課件.1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的94℃變性50-65℃退火XX℃延伸4ppt課件.94℃變性50-65℃退火XX℃延伸4ppt課件.94℃55℃37℃5ppt課件.94℃55℃37℃5ppt課件.TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)6ppt課件.TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶72℃94℃55℃PCR循環(huán)7ppt課件.72℃94℃55℃PCR循環(huán)7ppt課件.KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。“我不大喜歡動(dòng)手,我寧肯不動(dòng)手,我不喜歡做費(fèi)力的事。作為一個(gè)發(fā)明家,重要的一點(diǎn)是為解決某些問(wèn)題而盡力設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)捷的動(dòng)手方案?！边@是PCR的發(fā)明者M(jìn)ullis在1991年對(duì)《研究與發(fā)展》雜志(R&D)記者說(shuō)的一番話8ppt課件.KaryB.Mullis<<TheUnu第一節(jié)PCR技術(shù)原理和

工作方式第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用9ppt課件.第一節(jié)PCR技術(shù)原理和

工作方式第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用一、PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。10ppt課件.一、PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制10ppt課件.11ppt課件.11ppt課件.PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；12ppt課件.PCRCycle-Step1-DenaturatPCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；13ppt課件.PCRCycle-Step2–

TemperaPCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。14ppt課件.PCRCycle-Step3-

At72Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。15ppt課件.Endofthe1stPCRCycle–

RPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

16ppt課件.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件重復(fù)30輪后模板DNA第1輪擴(kuò)TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon17ppt課件.TargetAmplificationNo.of No.1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍18ppt課件.1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)二、PCR反應(yīng)體系緩沖液dNTP引物模版DNA聚合酶19ppt課件.二、PCR反應(yīng)體系緩沖液19ppt課件.1.緩沖液標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液含10mMTris·HClpH為8.3-9.0（室溫），而在延伸溫度（72℃）下，pH值接近7.2緩沖液中含有一種二價(jià)陽(yáng)離子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+

，有時(shí)使用Mn2+

緩沖液中還含有50mM的鉀離子有些緩沖液中還加入一些添加劑和共溶劑可降低錯(cuò)配率，提高富含G+C模板的擴(kuò)增效率。20ppt課件.1.緩沖液標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液含10mMTris·HCl20Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。一般以MgCl2的形式提供，標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.5mM。Mg2+濃度的高低會(huì)影響擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)率21ppt課件.Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。21ppt課件.2.dNTP脫氧核苷三磷酸是DNA合成的底物標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中含有等摩爾濃度的4種dNTP，終濃度一般為200mM（即飽和濃度）濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。22ppt課件.2.dNTP脫氧核苷三磷酸是DNA合成的底物22ppt3.引物在多數(shù)試驗(yàn)中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各1mM，即1pmol/ml濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降23ppt課件.3.引物在多數(shù)試驗(yàn)中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各1mM，引物設(shè)計(jì)原則①引物長(zhǎng)度一般以18～30bp為宜，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。②避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。24ppt課件.引物設(shè)計(jì)原則①引物長(zhǎng)度一般以18～30bp為宜，過(guò)短則降低特④要避免兩個(gè)引物間特別是3`末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3`末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。⑤引物3`末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3`末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高。⑥引物5`末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。⑦引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。25ppt課件.④要避免兩個(gè)引物間特別是3`末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身26ppt課件.26ppt課件.27ppt課件.27ppt課件.28ppt課件.28ppt課件.29ppt課件.29ppt課件.30ppt課件.30ppt課件.4.模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。用人類或哺乳動(dòng)物基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，一般使用1μgDNA以酵母菌、細(xì)菌、質(zhì)粒和M13噬菌體噬菌斑的DNA作模板時(shí)，分別需要10ng，1ng，1pg和1%噬菌斑。31ppt課件.4.模板單、雙鏈DNA均可。31ppt課件.5.DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶來(lái)自嗜熱古細(xì)菌的嗜熱水生菌（Thermusaquaticus），TaqDNA聚合酶分子量大小為94kDa，為單分子酶，在75℃活性最強(qiáng)。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,但是無(wú)3’-5’外切活性。由于沒(méi)有3'-5'外切活性，在擴(kuò)增過(guò)程中有8.9-11x10-5

的錯(cuò)配幾率。在95℃的半衰期為40分鐘。啟動(dòng)PCR反應(yīng)的能力很強(qiáng)，聚合速度快，在72℃的聚合速度為每秒30-100堿基。32ppt課件.5.DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶32ppt課件.②TthDNA聚合酶TthDNA聚合酶來(lái)自嗜熱熱細(xì)菌（Thermusthermophilus）HB8，由Promega公司開發(fā)成商品。TthDNA聚合酶分子量為94kDa，在74℃進(jìn)行擴(kuò)增，在95℃的半衰期為20分鐘。在Mg2+

存在條件下以DNA為模板合成DNA，而在MnCl2

存在下可以RNA為模板合成cDNA。因此可在高溫下做RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄和引物延伸（primerextension）反應(yīng)，避免RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。33ppt課件.②TthDNA聚合酶33ppt課件.③VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶是從由火山口分離的嗜熱球菌Thermococcuslitoralis中分離的第一個(gè)具有3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶，由NewEnglandBlabs公司開發(fā)出商品。酶分子為85kDa，具有更長(zhǎng)的半衰期，在100℃（使用MgSO4）時(shí)，其半衰期為1.8小時(shí)。34ppt課件.③VentDNA聚合酶34ppt課件.④PwoDNA聚合酶PwoDNA聚合酶來(lái)自Pyrococcuswoesei（BM），大小為90kDa，由原德國(guó)寶靈曼公司開發(fā)。在100℃的半衰期大于2小時(shí)，出錯(cuò)率低。是使用較多的具有3'-5'外切活性的且具有高保真度的PCR酶。35ppt課件.④PwoDNA聚合酶35ppt課件.⑤PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶來(lái)自激烈熱球菌具有理想的擴(kuò)增保真度，具有極高的熱穩(wěn)定性，是目前使用最廣泛的具有3'-5'外切活性的PCR酶。⑥商用混合酶為了提高擴(kuò)增的保真度或擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段，將TaqDNA聚合酶的強(qiáng)啟動(dòng)能力和具有3'-5'外切活性的高溫DNA聚合酶的高持續(xù)活性和校正功能結(jié)合起來(lái)，可以達(dá)到很好的效果。36ppt課件.⑤PfuDNA聚合酶36ppt課件.三、PCR反應(yīng)程序（1）變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈95℃20-30秒

(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。37ppt課件.三、PCR反應(yīng)程序（1）變性37ppt課件.（3）延伸70-75℃延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加38ppt課件.（3）延伸38ppt課件.PCR反應(yīng)中的注意事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無(wú)菌操作（二）設(shè)立對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分39ppt課件.PCR反應(yīng)中的注意事項(xiàng)（一）防止污染39ppt課件.第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用40ppt課件.第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用40ppt一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)為了使PCR產(chǎn)物能夠方便的裝載到克隆載體上，可在擴(kuò)增的過(guò)程中在其兩端添加限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：正常的特異性序列、在引物的5‘末端添加酶切位點(diǎn)、保護(hù)序列、在選擇酶切位點(diǎn)的種類時(shí)，要保證所選的酶切位點(diǎn)在擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部不存在。如果對(duì)擴(kuò)增的DNA片段的序列不清楚，可優(yōu)先選用切割頻率相對(duì)較少甚至酶切位點(diǎn)為8個(gè)堿基序列的酶切位點(diǎn)。41ppt課件.一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)為了使PCR產(chǎn)物二、A/T克隆法TaqDNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性可在DNA片段的3‘末端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。因此TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克隆的目的T-載體最初由Promega公司開發(fā)出商品，并一直沿用到現(xiàn)在，如和pGEM-TEasy42ppt課件.二、A/T克隆法TaqDNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性443ppt課件.43ppt課件.在DNA的3’末端添加一個(gè)T堿基的方法:如用末端轉(zhuǎn)移酶和底物ddTMP可以產(chǎn)生單個(gè)T的突出末端有些識(shí)別不對(duì)稱序列的限制性內(nèi)切酶，如MboⅡ、XcmⅠ和HphⅠ，在切割DNA后可直接產(chǎn)生一個(gè)3’突出的T用TaqDNA聚合酶和高濃度的dTTP也可產(chǎn)生3'突出的T44ppt課件.在DNA的3’末端添加一個(gè)T堿基的方法:44pp45ppt課件.45ppt課件.三、平末端DNA片段的克隆1pPCR-ScriptAmpSK（+）克隆載體該載體從pBluescriptⅡSK（+）噬菌粒改造而來(lái)，將多克隆位點(diǎn)中的

XbaⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)改成

SrfⅠ位點(diǎn)（5′-GCCC/GGGC-3′）?？寺NA片段時(shí)，先將載體用SrfⅠ切成線狀，再與目標(biāo)DNA片段混合作連接反應(yīng)。在連接體系中除了添加T4DNA連接酶外，還加入SrfⅠ酶。在這個(gè)反應(yīng)體系中，當(dāng)載體發(fā)生自連后，SrfⅠ酶又會(huì)將其切開，載體就處于酶切與連接的動(dòng)態(tài)平衡中只有當(dāng)載體與目標(biāo)DNA片段連接后，酶學(xué)反應(yīng)才能穩(wěn)定下來(lái)，從而將總體的反應(yīng)平衡向載體與目標(biāo)DNA片段連接這個(gè)方向傾斜。46ppt課件.三、平末端DNA片段的克隆1pPCR-ScriptAmp2pCR-Blunt克隆載體pCR-Blunt載體最大特點(diǎn)是在lacZ’基因的下游融合了一個(gè)ccdB基因，該基因?qū)Υ竽c桿菌是致死的。該載體大小為3.5kb，含卡那霉素抗性基因和Zerocin抗性基因在克隆外源平末端DNA片段時(shí)，先將改載體切成線狀，再與目標(biāo)DNA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌如果載體發(fā)生自連，獲得這些載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞就會(huì)死亡，只有當(dāng)外源DNA片段與載體連接后，ccdB基因的表達(dá)受到阻斷，重組質(zhì)粒才能在大腸桿菌中存在下來(lái)。47ppt課件.2pCR-Blunt克隆載體47ppt課件.四、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增在長(zhǎng)片段的PCR擴(kuò)增過(guò)程中高溫會(huì)降低緩沖液的緩沖能力，從而損害模板DNA和PCR產(chǎn)物在高溫下其它二價(jià)離子的存在會(huì)促進(jìn)DNA的裂解長(zhǎng)片段DNA分子的變性比短片段困難DNA聚合酶與模板DNA的趨近和結(jié)合變得困難錯(cuò)配堿基的摻入導(dǎo)致DNA聚合酶的作用不能正常發(fā)揮，從而限制產(chǎn)物的長(zhǎng)度。48ppt課件.四、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增在長(zhǎng)片段的PCR擴(kuò)增過(guò)程中4為了提高擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度一方面改進(jìn)緩沖體系另一方面采用混合DNA聚合酶即主體使用擴(kuò)增效率高、延伸能力強(qiáng)的TaqDNA聚合酶；少量使用具有3‘-5’外切活性的高溫DNA聚合酶（如Pfu或PwoDNA聚合酶），及時(shí)切除不匹配堿基的摻入這樣可使擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA有效實(shí)施,可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)40kb的DNA片段49ppt課件.為了提高擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度49ppt課件.第三節(jié)PCR擴(kuò)增未知DNA片段第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用50ppt課件.第三節(jié)PCR擴(kuò)增未知DNA片段第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用5一、反向PCR二、利用接頭的PCR三、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR51ppt課件.一、反向PCR51ppt課件.一、反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列52ppt課件.一、反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶53ppt課件.已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶53ppt課件.二、利用接頭的PCR54ppt課件.二、利用接頭的PCR54ppt課件.三、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCRTAIL-PCR(TermalAsymmetricInterlacedPCR)目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。用途制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究，染色體步查55ppt課件.三、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCRTAIL-PCR(TermalAsy在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成(1)由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物(2)由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物(3)由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，其中后2種產(chǎn)物可以通過(guò)以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來(lái)消除。

56ppt課件.在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成56p原理TAIL-PCR的基本原理利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprimer，簡(jiǎn)稱sp1，sp2，sp3，約20bp)用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerateprime，AD，約14bp)相組合以基因組DNA為模板．根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物57ppt課件.原理TAIL-PCR的基本原理57ppt課件.步驟TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應(yīng)和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)5次高特異性反應(yīng)，使sp1與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)。58ppt課件.步驟TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。58ppt課件.經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物特異性產(chǎn)物(I)型和非特異性產(chǎn)物(II型和III型)。第二次反應(yīng)將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板通過(guò)10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，通過(guò)上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列59ppt課件.經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物59ppt課件.60ppt課件.60ppt課件.61ppt課件.61ppt課件.應(yīng)用Gento等曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因(hph)的雙元表達(dá)載體pBIG2RHPH2轉(zhuǎn)化真菌然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的T-DNA插入?yún)^(qū)的旁側(cè)序列根據(jù)T-DNA區(qū)的HPH基因設(shè)計(jì)了擴(kuò)增右邊界的3個(gè)引物HS1～HS3，以及擴(kuò)增左邊界的引物HAS2～HAS4，另外又根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化子分別設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物ADl～AD362ppt課件.應(yīng)用Gento等曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因(hph)的雙元63ppt課件.63ppt課件.第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用64ppt課件.第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用64p一、cDNA末端的快速擴(kuò)增RACERapidamplificationofcDNAend5’-RACE3’-RACE65ppt課件.一、cDNA末端的快速擴(kuò)增RACE65ppt課件.5’-RACEAAAAA······CCCCCCGGGGGG66ppt課件.5’-RACEAAAAA······CCCCCCGGGGGG巢式PCR67ppt課件.巢式PCR67ppt課件.二、差異顯示PCRDD-PCR流程圖68ppt課件.二、差異顯示PCRD68ppt課件.第五節(jié)PCR產(chǎn)生DNA指紋第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用69ppt課件.第五節(jié)PCR產(chǎn)生DNA指紋第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用69p一、多重PCR二、RAPD——隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR三、RFLP四、AFLP——擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR70ppt課件.一、多重PCR70ppt課件.一、多重PCR在一個(gè)反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上的引物用于等位基因的鑒定對(duì)每種類型的基因設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，并且產(chǎn)物大小彼此不同通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判斷樣品中基因類型檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失71ppt課件.一、多重PCR在一個(gè)反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上的引物71ppt課電泳引物72ppt課件.電泳引物72ppt課件.DMD：人類肌營(yíng)養(yǎng)不良基因A：無(wú)外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說(shuō)明病人外顯子8～19缺失B：正常強(qiáng)度的一半病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失73ppt課件.DMD：人類肌營(yíng)養(yǎng)不良基因A：無(wú)外顯子8,12,17,19對(duì)二、RAPD標(biāo)記隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCRrandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD1990年，由美國(guó)杜邦公司的科學(xué)家Williams推出RAPD方法是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它利用一系列單個(gè)隨機(jī)引物（通常為10個(gè)核苷酸），對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物與基因組DNA某一區(qū)段互補(bǔ)時(shí)，就與其結(jié)合，就可對(duì)引物下游DNA進(jìn)行合成，即擴(kuò)增。74ppt課件.二、RAPD標(biāo)記隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR74ppt課件.1.RAPD的基本概念和原理RAPD的引物（1）為隨機(jī)引物（2）序列較短（通常為10個(gè)核苷酸）（3）為一個(gè)寡核苷酸單鏈引物75ppt課件.1.RAPD的基本概念和原理RAPD的引物75ppt課件.0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系276ppt課件.0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb2.RAPD的基本實(shí)驗(yàn)程序1.DNA的提取（1）堿法（2）CTAB法（3）SDS法2.模板DNA濃度和質(zhì)量的檢測(cè)3.PCR擴(kuò)增4.電泳檢測(cè)：PCR結(jié)束后每個(gè)樣品加4ul凝膠上樣緩沖液，每個(gè)泳道點(diǎn)樣20ul。5.凝膠觀察、拍照。6.統(tǒng)計(jì)分析：記錄條帶清晰的RAPD條帶，計(jì)算帶紋相似率；計(jì)算DNA片段大小等。77ppt課件.2.RAPD的基本實(shí)驗(yàn)程序1.DNA的提取77ppt課件3.RAPD結(jié)果78ppt課件.3.RAPD結(jié)果78ppt課件.4.RAPD的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物不需知道序列信息。覆蓋整個(gè)基因組。具有廣泛適用性和通用性（2）用一個(gè)引物可擴(kuò)增出多片段（3）技術(shù)簡(jiǎn)單，需要樣品量少，成本低（4）每個(gè)RAPD標(biāo)記相當(dāng)于基因組分析中的靶序列位點(diǎn)，簡(jiǎn)化信息的轉(zhuǎn)移過(guò)程（5）可以對(duì)RFLP難以分析的基因組區(qū)域做出遺傳連鎖圖（6）分析自動(dòng)化79ppt課件.4.RAPD的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：79ppt課件.5.RAPD的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：（1）顯性標(biāo)記，無(wú)法區(qū)別顯性純合體和雜合體（2）對(duì)反應(yīng)條件敏感，重復(fù)性差包括模板濃度、Mg2+濃度，PCR反應(yīng)中條件的變化等（3）存在共遷移問(wèn)題不同個(gè)體相同分子量的片段不一定同源；一條帶可能包含不同的產(chǎn)物。80ppt課件.5.RAPD的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：80ppt課件.三、RFLP標(biāo)記RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子所產(chǎn)生的DNA片段在長(zhǎng)度上的變化。81ppt課件.三、RFLP標(biāo)記RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性81ppt課件1.RFLP原理生物能快速、精確地復(fù)制自身的DNA，但這種精確性是相對(duì)的實(shí)際上，在植物的自然群體中存在大量的DNA序列變異。如：堿基對(duì)的代換、缺失等幾乎不可能有兩個(gè)生物體DNA的堿基序列是相同的。限制性內(nèi)切酶酶解DNA長(zhǎng)鏈，是識(shí)別DNA上的特異的位點(diǎn)并在這些位點(diǎn)上切斷的過(guò)程酶識(shí)別位點(diǎn)堿基對(duì)越少，DNA分子中被識(shí)別的位點(diǎn)越多，所產(chǎn)生的限制片段越短。82ppt課件.1.RFLP原理生物能快速、精確地復(fù)制自身的DNA，但這種來(lái)自一個(gè)完整的純合子的個(gè)體的每一種同源DNA分子，都會(huì)在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確切割但是在不同物種、不同品種、甚至同一品種的不同的兩個(gè)個(gè)體之間，DNA會(huì)發(fā)生變異其中有些變異導(dǎo)致了限制性酶切位點(diǎn)的更動(dòng)，從而產(chǎn)生了限制片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。83ppt課件.來(lái)自一個(gè)完整的純合子的個(gè)體的每一種同源DNA分子，都會(huì)在同樣用限制性酶來(lái)酶解植物核DNA會(huì)產(chǎn)生數(shù)萬(wàn)個(gè)片段，其大小變化是連續(xù)的如進(jìn)行電泳分離，只能看到彌散狀的連成一片的電泳結(jié)果然而，各限制片段在凝膠中還是分開的，但不能分辨進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移操作，用特定的探針與濾膜上的DNA雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影就能檢測(cè)到高等植物核DNA的RFLP84ppt課件.用限制性酶來(lái)酶解植物核DNA會(huì)產(chǎn)生數(shù)萬(wàn)個(gè)片段，其大小變化是連0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb0.5kb×(1)(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系20.4kb0.1kb+–85ppt課件.0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb2.RFLP的方法與步驟（1）DNA的分離：可用CTAB法或SDS法（2）酶切：一般根據(jù)基因組總DNA的復(fù)雜性選用限制酶。（3）瓊脂糖凝膠電泳（4）Southern印跡轉(zhuǎn)移（5）DNA雜交及放射自顯影86ppt課件.2.RFLP的方法與步驟（1）DNA的分離：可用CTAB法3.RFLP的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)（1）不受性別、年齡局限，不會(huì)受表達(dá)的組織、發(fā)育階段或外界環(huán)境的不同而受影響（2）標(biāo)記座位的等位基因間是共顯性的，通過(guò)雜交后電泳帶型可直接區(qū)別雜合子和顯性純合子（3）RFLP標(biāo)記源于基因組DNA自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制。87ppt課件.3.RFLP的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)87ppt課件.4.RFLP的缺點(diǎn)缺點(diǎn)（1）DNA需要量大。5~10μg（2）所需一起較多（3）技術(shù)較為復(fù)雜（4）大多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性，雜合率低于50%，所提供的信息量較低（5）與內(nèi)切酶選用密切相關(guān)88ppt課件.4.RFLP的缺點(diǎn)缺點(diǎn)88ppt課件.四、AFLP標(biāo)記AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性amplifiedfragmentlengthpolymorphism

AFLP技術(shù)是1992年由荷蘭Keygene公司的科學(xué)家ZabeauMare和VosPieter發(fā)明并發(fā)展起來(lái)的一種選擇擴(kuò)增限制酶切片段的方法。89ppt課件.四、AFLP標(biāo)記AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性89ppt課件.1.AFLP的基本原理植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化形成相對(duì)分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段隨后將特定的接頭連接在這些DNA片段兩端，接頭序列和鄰近限制性酶切位點(diǎn)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增最后通過(guò)PAGE分離擴(kuò)增的特異限制性片段在不需要DNA序列的情況下，利用一套特定引物可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。90ppt課件.1.AFLP的基本原理植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化形AFLP引物是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長(zhǎng)度為18~20個(gè)核苷酸。引物主要由3部分組成：（1）核心序列（CORE），該序列與人工接頭互補(bǔ)；（2）限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異序列（ENZ）；（3）選擇性延伸序列（EXT），即引物3端的選擇堿基，選擇堿基延伸到酶切片段區(qū)。如：EcoRI引物和MseI引物COREENZEXTEcoRI5′-GACTGCGTACCAATTCNNN-3′MseI5′-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3′91ppt課件.AFLP引物是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長(zhǎng)度為18~22.AFLP的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）少量引物可獲得較多標(biāo)記，50~150條帶（2）多為顯性標(biāo)記或共顯性標(biāo)記，受環(huán)境影響小，無(wú)復(fù)等位效應(yīng)（3）帶型清晰，具高分別率（4）由于用兩種引物經(jīng)兩步選擇擴(kuò)增，帶型穩(wěn)定，帶紋豐富，靈敏度高，重復(fù)性好（5）不需事先知道DNA序列信息缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)用較高92ppt課件.2.AFLP的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：92ppt課件.五、SSR標(biāo)記SSR：簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性，也叫微衛(wèi)星標(biāo)記simplesequencerepeat微衛(wèi)星：即短串聯(lián)重復(fù)(Short

Tandem

Repeat，STR)它是由2-6bp重復(fù)單位構(gòu)成的DNA序列，通常多態(tài)性片段長(zhǎng)度在100-300bp以人類基因組為例，平均每15-20kb就存在1個(gè)STR座位，據(jù)此估計(jì)整個(gè)人類基因組中大約有50,000-100,000個(gè)STR位點(diǎn)。由于微衛(wèi)星DNA具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，所以非常適合作為遺傳學(xué)DNA分子標(biāo)記93ppt課件.五、SSR標(biāo)記SSR：簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性，也叫微衛(wèi)星標(biāo)記93六、ISSR標(biāo)記ISSRinter-simplesequencerepeat是Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來(lái)的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記94ppt課件.六、ISSR標(biāo)記ISSR94ppt課件.其基本原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2-4個(gè)隨機(jī)核昔酸在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增所擴(kuò)增的interSSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過(guò)聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。95ppt課件.其基本原理是95ppt課件.ISSR的優(yōu)點(diǎn)ISSR引物的開發(fā)不像SSR引物那樣需測(cè)序獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開發(fā)費(fèi)用降低與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標(biāo)記一樣具有較強(qiáng)的種特異性與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測(cè)非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。96ppt課件.ISSR的優(yōu)點(diǎn)ISSR引物的開發(fā)不像SSR引物那樣需測(cè)序獲得第六節(jié)實(shí)時(shí)定量PCR第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用97ppt課件.第六節(jié)實(shí)時(shí)定量PCR第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用97ppt課熒光定量PCR（real-timePCR)通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。98ppt課件.熒光定量PCR（real-timePCR)98ppt課件一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方式99ppt課件.一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方式99ppt課件.100ppt課件.100ppt課件.101ppt課件.101ppt課件.熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。102ppt課件.熒光閾值102ppt課件.103ppt課件.103ppt課件.二、熒光標(biāo)記方式內(nèi)摻式染料SYBRGreenI序列特異性探針原理：DualProbes(FRET)（熒