【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)

常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)植物病毒研究所楊靚2011年12月5日常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)植物病毒研究所楊靚重組DNA技術(shù)的原理重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序也稱為分子克隆技術(shù),基因克隆或基因工程供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件重組DNA技術(shù)的原理重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的3DNA的體外重組3DNA的體外重組4EcoRⅠ5‘……3’3‘……5’

回文序列palindromicseq限制性核酸內(nèi)切酶4EcoRⅠ5‘…SmaICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC

粘性末端cohensiveend

平末端bluntendSmaICCCGGGCCCGGG粘性末端cohens6DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶催化雙鏈DNA一端3ˊ-OH與另一雙鏈DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA兩端連接起來。6DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶催化雙鏈

限制性內(nèi)切酶識(shí)別的靶序列與DNA的來源無關(guān)，任何不同來源的DNA，經(jīng)過適當(dāng)限制酶處理后，都能通過它們的粘性或平齊末端連接起來，這是DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的靶序列與DNA的來源無關(guān)，任何不同8重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序8重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于9陽性克隆的篩選和檢測(cè)目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶載體自連目的基因自連重組體9陽性克隆的篩選和檢測(cè)目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶D10陽性克隆的檢測(cè)方法抗藥性標(biāo)記選擇藍(lán)白斑篩選分子雜交法插入片段大小的鑒定（酶切，PCR）測(cè)序---10陽性克隆的檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的各種DNA片段及其排列次序ORF

酶切位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法和操作DNA體外重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)DNA體外重組技術(shù)

基因工程的操作過程酶切連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增檢測(cè)目的基因的獲取克隆載體的構(gòu)建外源基因與載體的連接（體外重組）重組DNA導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定克隆基因的表達(dá)基因工程的操作過程酶切連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增檢測(cè)目的基因的獲取克13目的基因的克隆基因工程或DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物體中分離克隆目的基因。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；

另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。13目的基因的克隆基因工程或DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物14

核酸的提取及檢測(cè)

就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要對(duì)象，所以核酸的分離與提取是研究中很重要的基本技術(shù)。核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。14核酸的提取及檢測(cè)就基因工程而言，核酸分子是其研究所15基因組DNA的分離與純化DNA主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA?？偟脑瓌t保證一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染15基因組DNA的分離與純化DNA主要存在于細(xì)胞核的染色體中16一般步驟(1)破碎細(xì)胞，裂解細(xì)胞壁機(jī)械方法:超聲波處理、研磨、勻漿化學(xué)方法:SDS（陰離子去垢劑）

EDTA，使得DNase失活(why?)

酶學(xué)方法:溶菌酶或蝸牛酶(2)通過蛋白質(zhì)變性或分解，使DNA游離出來(3)分離DNA16一般步驟(1)破碎細(xì)胞，裂解細(xì)胞壁17cDNA的分離與純化（1）mRNA分離RNase，不需輔助因子，耐酸堿，分布極廣RNase的來源外源：操作者，實(shí)驗(yàn)器皿，試劑，空氣內(nèi)源：不同組織和細(xì)胞數(shù)量不同創(chuàng)造無RNase的環(huán)境

—DEPC(焦碳酸二乙酯

—異硫氰酸胍Trizol試劑17cDNA的分離與純化（1）mRNA分離18（2）Thefirststrandsynthesis18（2）Thefirststrandsynthesi19cDNA第二鏈的合成方法－置換合成法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈，不用堿變性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。注意：反轉(zhuǎn)錄酶除了具有聚合活性，還有RNaseH（降解DNA/RNA中的RNA）活性。19cDNA第二鏈的合成方法－置換合成法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶20cDNA第二鏈的合成方法－置換合成法DNApoldNTPsRNaesH5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase該方法使用較多20cDNA第二鏈的合成方法－置換合成法DNApoldN21質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒plasmid:指細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外能自主復(fù)制的遺傳單位共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的分離：細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA擴(kuò)增；細(xì)菌菌體的裂解；質(zhì)粒DNA的分離21質(zhì)粒DNA的分離與純化質(zhì)粒plasmid:指細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒DNA－堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，核酸的檢測(cè)包括DNA的質(zhì)量、大小、純度檢測(cè)分光光度計(jì)法

dsDNA：1A260≈50ug/mlssDNA，RNA：1A260≈40ug/ml

寡聚核苷酸：1A260≈20ug/mlA260/A280＝

1.65～1.85（DNA）；2.0(RNA)

比值高，有蛋白質(zhì)、酚類等污染凝膠電泳法核酸的檢測(cè)包括DNA的質(zhì)量、大小、純度檢測(cè)原理電泳及遷移率核苷酸鏈多聚陰離子

在生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的。相同分子量的雙鏈DNA幾乎具有等量凈電荷無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)降低了對(duì)流運(yùn)動(dòng)，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異，所帶的凈電荷的多寡，便彼此分離開來。原理電泳及遷移率瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖為線性多糖聚合物，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固，密度由濃度決定的。分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān):瓊脂糖凝膠分辨范圍為0.2～50kb之間.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖為線性多糖聚合物，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力凝膠類型及濃度

分離DNA片段的大小范圍（bp）

0.3％瓊脂糖50000～10000.7％瓊脂糖20000～10001.4％瓊脂糖6000～3004.0％瓊脂糖1000～10010％瓊脂糖500～2520％瓊脂糖50～1不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力凝膠類型及濃度分離DNA片段27電泳裝置27電泳裝置凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)它不單是一種分析的手段，同時(shí)也可以用來制備和純化特定的DNA片段。在這方面，低熔點(diǎn)（LMP）的瓊脂糖凝膠較為方便。LMP瓊脂糖是一種熔點(diǎn)為62～65℃的瓊脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持續(xù)保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小時(shí)之久，而在25℃下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10分鐘。LMP瓊脂糖可以不經(jīng)電洗脫或破碎凝膠，即可用來回收DNA分子。凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)它不單是一種分析的手段，同時(shí)也可以用來制備和純常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中

呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈蘭色，在1%和1.4%瓊脂糖中遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA相似.指示劑一般與蔗糖、甘油組成載樣緩沖液.作用有①增加樣品密度.②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，加樣操作更方便

指示劑常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中溴化乙錠染色溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr），是一種具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子結(jié)合，卻不能同瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合并在300nm紫外光照射下放射出，可顯現(xiàn)凝膠中0.05ug的微量DNA

方法：加入凝膠中，凝膠浸泡重要的特性：熒光強(qiáng)度同DNA片段的大小或數(shù)量成正比。在包含有數(shù)種DNA片段的電泳譜帶中，每一條帶的熒光強(qiáng)度是隨著從最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐漸降低的。溴化乙錠染色溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱31操作過程31操作過程DNA分子大小的檢測(cè)NEB，1KbDNALadder：3kb=62.5ng，1kb=21.0ngPCR產(chǎn)物3Kb1KbDNA分子大小的檢測(cè)NEB，1KbDNALadder：3提高轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)的策略轉(zhuǎn)錄水平使用高表達(dá)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等表達(dá)調(diào)控元件。翻譯水平使用翻譯增強(qiáng)元件和植物偏愛密碼子。翻譯后水平將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定向表達(dá)在一個(gè)合適的細(xì)胞分隔。提高轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)的策略轉(zhuǎn)錄水平SCMRP基因設(shè)計(jì)、合成⑴根據(jù)大豆密碼子用法分析結(jié)果，對(duì)富含甲硫氨酸玉米醇溶蛋白基因序列進(jìn)行重新編寫，并在基因的5′端依次設(shè)計(jì)添加omega、AACAATG序列，基因3′端依次設(shè)計(jì)添加加尾信號(hào)序列、剪切序列；⑵獲得改造的富含甲硫氨酸蛋白質(zhì)基因序列——SCMRP（專利申請(qǐng)?zhí)枺?00410043869.0）SCMRPkozakomega加尾和剪切序列XbaIKpnIHpaISacISCMRP基因設(shè)計(jì)、合成⑴根據(jù)大豆密碼子用法分析結(jié)果，對(duì)富圖3植物表達(dá)載體pBENM的構(gòu)建圖4植物表達(dá)載體pBENM酶切鑒定結(jié)果M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000；泳道1：質(zhì)粒pUMAXbaI和SacI雙酶切產(chǎn)物；泳道2：質(zhì)粒pBENTXbaI和SacI雙酶切產(chǎn)物；泳道3：質(zhì)粒pBENMXbaI和SacI雙酶切產(chǎn)物。圖3植物表達(dá)載體pBENM的構(gòu)建圖4植物表達(dá)載體pBENORFORF

酶切位點(diǎn)通過克隆載體引入酶切位點(diǎn)通過PCR引入酶切位點(diǎn)（需測(cè)序）部分酶切Adaptor的使用克隆的先后次序酶切位點(diǎn)通過克隆載體引入酶切位點(diǎn)通過克隆載體引入酶切位點(diǎn)部分酶切Adaptor的使用部分酶切Adaptor的使用通用植物表達(dá)載體pBHT-5的構(gòu)建

SfiASfiB

克隆位點(diǎn)的引入通用植物表達(dá)載體pBHT-5的構(gòu)建SfiA克隆銜接頭設(shè)計(jì)

BS1:5’-GATCCGTACGTGGCCATTA-3’BS2:3’-GCATGCACCGGT-5’

SS1:5’-CGGCCGACTGGAGCT-3’SS2:3’-GGAGCCGGCTGACC-5’銜接頭設(shè)計(jì)克隆的先后次序克隆的先后次序

實(shí)驗(yàn)方法和操作質(zhì)粒DNA的提取酶切與回收連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子的鑒定實(shí)驗(yàn)方法和操作

質(zhì)粒DNA的提取采用堿變性小量提取法：挑取單菌落，加5ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液加入1.5ml離心管，4000r/min，離心5min，盡可能棄去上清。加100μL溶液Ⅰ，強(qiáng)烈振蕩至細(xì)胞均勻分散，室溫放置5min。加200μL溶液Ⅱ，顛倒混勻，動(dòng)作要輕，冰浴5min。加150μL溶液Ⅲ，顛倒2~3次混勻，冰浴5min。4℃，12000r/min，離心10min，將上清移至新管，小心不要將沉淀吸入。用等體積苯酚∶氯仿抽提。4℃，12000r/min，離心5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚∶氯仿。加兩倍體積95%的冰乙醇，顛倒混勻，4℃，12000r/min，離心10min。用70%乙醇清洗沉淀。倒掉乙醇，吹干。加入適量TE溶解電泳檢測(cè)。質(zhì)粒DNA的提取采用堿變性小量提取法：酶切與回收雙酶切體系的建立DNA的質(zhì)量（不需要加大酶量）凝膠重量回收片段的質(zhì)量（大片段降解？連接比）酶切與回收雙酶切體系的建立連接連接體系（需要調(diào)整）載體和DNA片段的大小PEG的添加（T載體、平末端連接）連接條件：溫度（粘性、平末端）4度、16度、22度1MNaCl（轉(zhuǎn)化）連接連接體系（需要調(diào)整）轉(zhuǎn)化子的鑒定轉(zhuǎn)化子的鑒定PCR技術(shù)要點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用基因的分離和克隆基因修飾、改造轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)PCR技術(shù)要點(diǎn)PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用引物設(shè)計(jì)的原則（一）①引物長度：15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物設(shè)計(jì)的原則（一）①引物長度：15-30bp，常用為20引物設(shè)計(jì)的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶（熱啟動(dòng)PCR）。⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物設(shè)計(jì)的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)引物設(shè)計(jì)的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。對(duì)于比較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物配合使用是很有效的（巢式PCR）。

引物設(shè)計(jì)的原則（三）⑦引物的特異性：Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。

退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。（梯度降落PCR）復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要延伸時(shí)間：根據(jù)所用Taq酶種類和待擴(kuò)增片段長度而定使用有校讀功能的酶應(yīng)延長延伸時(shí)間；1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min就足夠了；3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些延伸時(shí)間：根據(jù)所用Taq酶種類和待擴(kuò)增片段長度而定基因克隆的一種方法

——RACE基因克隆的一種方法

——RACE基于同源序列的克隆技術(shù)已克隆的一些基因（轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶類的基因）在氨基酸水平上表現(xiàn)出一定程度的相似性，在一些區(qū)段高度保守，這些保守的結(jié)構(gòu)區(qū)不僅有助于基因的分離及作用機(jī)理的理解，而且也為基因克隆提供了一條快捷途徑。這就是基于同源序列的候選基因法（homology-basedcandidategenemethod）。其基本思路是：根據(jù)已知克隆的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到該基因的類似序列，檢測(cè)這些序列與性狀共分離情況。如果這些序列與性狀緊密相關(guān)或帶有該基因功能結(jié)構(gòu)區(qū)序列，則可用于其作為探針篩選基因組文庫，獲得候選基因；或者通過擴(kuò)增末端的方法克隆全長基因。基于同源序列的克隆技術(shù)已克隆的一些基因（轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶類SequenceanalysisofgeneGsCBRLK——ByPh.D.LiangYangSequenceanalysisofgeneGsCBSequenceanalysisofgeneGsCBRLK——ByPh.D.LiangYangThehydrophilicresidueswereillustratedascircles,hydrophobicresiduesasdiamonds,potentiallynegativelychargedastriangles,andpotentiallypositivelychargedaspentagons.Hydrophobicityiscolorcodedwithgreen(themosthydrophobicresidue)andyellow(zerohydrophobicity)withtheamountofgreendecreasingproportionallytothehydrophobicity.Hydrophilicresiduesarecodedredwithpureredbeingthemosthydrophilic(uncharged)residue,andtheamountofreddecreasesproportionallytothehydrophilicity.ThepotentiallychargedresiduesarecodedlightblueFig.2AhelicalwheelprojectionpredictionofCaMBDinproteinGsCBRLKSequenceanalysisofgeneGsCB目前，這種方法已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。在抗病方面已經(jīng)應(yīng)用很廣泛，已在大豆，馬鈴薯、水稻、小麥、大麥、番茄和玉米中分離到了許多于已知抗病基因同源的DNA片段。在植物滲透脅迫相關(guān)基因的克隆方面，Urao等利用這一方法，根據(jù)蛋白激酶保守功能結(jié)構(gòu)區(qū)和CDPK特有的E-F手性結(jié)構(gòu)區(qū)序列設(shè)計(jì)簡并引物，從擬南芥中分離了編碼CDPK的2個(gè)cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK2)，并通過功能分析驗(yàn)證了這兩個(gè)基因在植物抗?jié)B透脅迫中的作用。這些研究證明了同源性克隆技術(shù)分離植物抗逆性基因的可行性。目前，這種方法已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。在抗病方面已經(jīng)應(yīng)用基因克隆的一種方法－RACERACE的基本概念不同廠家RACE試劑盒的介紹RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在的問題及解決辦法基因克隆的一種方法－RACERACE的基本概念RACE的基本概念cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法，為Frohman在1985年首次報(bào)道。3’RACE和5’RACE介紹一下不同公司生產(chǎn)的RACE試劑盒的特點(diǎn)RACE的基本概念cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidampl3’RACE原理示意圖3’RACE原理示意圖mRNA(A)n5’GSP3’5’

3’CC…CCGSP2

GI…IG5’AAPAUAPnestedGSP

3’CC…CC5’GI…IG5’3’3’AUAPnestedGSP5’原理示意圖3’5’(A)n5’mRNA(A)n5’GSP3’5’【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)【大學(xué)課件】常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有2個(gè)：3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄、TdT加尾、PCR擴(kuò)增)RACE的引物即使3個(gè)酶促反應(yīng)均平穩(wěn)順利進(jìn)行，但結(jié)果也通常會(huì)出現(xiàn)一些非特異性產(chǎn)物或非全長的產(chǎn)物背景。RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有2個(gè)：存在的問題及解決辦法反轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量

有高質(zhì)量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至關(guān)重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作沒有結(jié)果既浪費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)試劑，給試驗(yàn)帶來麻煩。

反轉(zhuǎn)錄提前終止

模板中有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄提前終止。通過提高反轉(zhuǎn)錄的溫度，加大反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄過程中一直保持已變性的RNA模板處于50℃以上，避免以解開二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA再恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，以達(dá)到5’末端。

存在的問題及解決辦法反轉(zhuǎn)錄提供一種改進(jìn)的反轉(zhuǎn)錄方法在RNase-free的0.2mLEppendorf管中加入以下成分：Oligo(dT)(0.5μg)1μLTotalRNA(4~5μg)3μLDEPC-H2OTo25μL

混勻，70℃保溫10min；50℃保溫5min；稍微離心一下。在混合物中，依次加入以下成份：10XSSⅡ（SSⅢ

）Buffer5.0μL10mMdNTPmix1.0μL0.1MDTT2.0μLRNaseInhibitor(40U/μL)1.0μLDEPC-H2OTo24μL

輕輕混合，在50℃保溫5min后，在50℃下將3號(hào)管中的混合成分移入2號(hào)管中。每個(gè)反應(yīng)加入1μLSuperScriptTMⅡ（SSⅢ

），輕輕混勻，50℃反應(yīng)50min。70℃放置15min以終止反應(yīng)。-20℃保存。提供一種改進(jìn)的反轉(zhuǎn)錄方法在RNase-free的0.2mLTdT加尾反應(yīng)及其替代反應(yīng)首先在反轉(zhuǎn)錄后，一些無用的核苷酸和過多的cDNA引物的存在會(huì)干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，從而導(dǎo)致第二鏈cDNA合成效率的降低。其次，TdT反應(yīng)難以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全長cDNA，這樣產(chǎn)生的非全長的cDNA將和全長產(chǎn)物一起完成PCR反應(yīng)，而且會(huì)優(yōu)先擴(kuò)增，不能保證在PCR反應(yīng)中有足夠的全長產(chǎn)物能被探測(cè)。TdT加尾反應(yīng)及其替代反應(yīng)TdT加尾反應(yīng)及其替代反應(yīng)第三，若目的cDNA中含有與多聚尾互補(bǔ)的幾個(gè)核苷酸同聚區(qū)，則在合成第二條cDNA鏈時(shí)引物的延伸會(huì)從內(nèi)部序列而不是末端序列開始，產(chǎn)生非全長的第二條cDNA鏈。我們所使用Invitrogen公司的RACE試劑盒，采用PCR介導(dǎo)的連接反應(yīng)，在一定程度上避免了以上的問題。RACE試劑盒中末端轉(zhuǎn)移的是多聚C尾，這樣在反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈時(shí)5’端多聚G的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響反轉(zhuǎn)錄的徹底進(jìn)行，會(huì)產(chǎn)生提前終止反應(yīng)。我們改進(jìn)了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，結(jié)果降低了反轉(zhuǎn)錄的難度，兩個(gè)基因最終均獲得了完整的5’末端。

TdT加尾反應(yīng)及其替代反應(yīng)RACE引物的設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)過程中總結(jié)如下經(jīng)驗(yàn)：引物不能設(shè)計(jì)在保守區(qū)簡并引物區(qū)。各引物之間盡量不要重疊，由于引物的重疊，會(huì)引起很嚴(yán)重的引