基因克隆簡(jiǎn)介課件

基因克隆簡(jiǎn)介基因克隆簡(jiǎn)介1一.DNA分子克隆的基本原理基因克?。╣enecloning）或分子克隆,又稱(chēng)為重組ＤＮＡ技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過(guò)程?？寺。╟lone）一指含有單一的DNA重組體的無(wú)性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系的過(guò)程(cloning)。一.DNA分子克隆的基本原理基因克隆（genecloni2一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟１.獲得待克隆的DNA片段（基因）；

２.目的基因與載體在體外連接；

３.重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；

４.篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；

５.重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟１.獲得待克隆的DNA片31.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱(chēng)寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。4基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件5二.用于基因克隆的工具酶二.用于基因克隆的工具酶61.1、限制酶概念提出的背景

20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱(chēng)為“限制現(xiàn)象”。

1962年，W．Arber提出一個(gè)假設(shè)來(lái)解釋上述現(xiàn)象。他認(rèn)為這是細(xì)菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別并切斷外來(lái)DNA分子的某些部位，使外來(lái)DNA失去活性，限制外來(lái)噬菌體的繁殖，另一種是修飾酶，可對(duì)自生的DNA進(jìn)行修飾。1.DNA限制性?xún)?nèi)切酶1.1、限制酶概念提出的背景1.DNA限制性?xún)?nèi)切酶7限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別并切斷外來(lái)DNA分子的某些部位，使外來(lái)DNA失去活性，限制外來(lái)噬菌體的繁殖，把這類(lèi)酶稱(chēng)為限制性核酸內(nèi)切酶。限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別并切斷外來(lái)DNA分子的某些部81.2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則限制酶的命名是采用Smith和Athens提議的方案，即名稱(chēng)的第個(gè)1字母取自它來(lái)源細(xì)菌屬名的第1個(gè)字母，大寫(xiě)；第2，3二個(gè)字母取自它來(lái)源細(xì)菌的種名的頭2個(gè)字母，小寫(xiě)；如果它的來(lái)源菌還有株系，則有第4個(gè)字母；最后用大寫(xiě)羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號(hào)。前三個(gè)字母用斜體表示。

1.2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則9EcoRIEscherichia屬名Coli種類(lèi)Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。如HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分離到的第3個(gè)限制酶。EcoRIEscherichia屬名Coli種類(lèi)Ry13株101.3、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)

根據(jù)其識(shí)別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類(lèi)。

I類(lèi)：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類(lèi)：基因工程的工具酶。Ⅲ類(lèi)：切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)，一般離識(shí)別位點(diǎn)25bp～27bp，對(duì)分子克隆操作亦無(wú)實(shí)用意義。1.3、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)根據(jù)其識(shí)別和切割序列的特性11首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。1.4II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在197012（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：從識(shí)別位點(diǎn)處EcoRV5’-GATüATC-3’

3’-CTA?TAG-5’Sam

I5’-GGGCCC-3’3’-CCCGGG-5

EcoRI5’-GüAATTC-3’3’-CTTAA?G-5’PstI5’-CTGCAüG-3’3’-G?ACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickye13（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。GüAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAA?G5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’（3）粘性末端（stickyends，cohensive14

①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只15基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件162.DNA連接酶從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。3.1DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。2.DNA連接酶從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能17（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。3.2DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。18基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件19（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：

NAD+2.連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH20基因載體是一類(lèi)能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。三.分子克隆的載體基因載體是一類(lèi)能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA21載體具以下特征：

1)具有自主復(fù)制能力；2）有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）3）有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；4）分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力

5）使用安全?？寺≥d體應(yīng)只存在有限范圍的宿主，在體內(nèi)不進(jìn)行重組，不發(fā)生轉(zhuǎn)移，不產(chǎn)生有害性狀，并且不能離開(kāi)宿主自由擴(kuò)散。載體具以下特征：

22多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker常用的載體有：質(zhì)粒，λ噬菌體，粘粒，病毒，BAC，YAC等。多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker231.質(zhì)粒(plasmid)載體

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

1.質(zhì)粒(plasmid)載體

Plasmid獨(dú)立于細(xì)241、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝）。4、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。1）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。1）25（1）分子量大，拷貝數(shù)低2）天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長(zhǎng)

9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr

作為篩選標(biāo)志。（2）篩選標(biāo)志不理想ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。（1）分子量大，拷貝數(shù)低2）天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克26

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。

3）發(fā)展概況pBR322質(zhì)粒是由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。

pBR322質(zhì)粒

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如27基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件28pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：

第一，具有較小的分子量。pBR322質(zhì)粒DNA分子為4363bp。

第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000～3000個(gè)拷貝。這就為重組DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：29基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件30抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板T31第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的篩選標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

2.7kb第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新32ＯＰZ編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。lacZ的a肽互補(bǔ)藍(lán)白斑選擇原理：①乳糖操縱子ＯＰZ編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。lac33異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside：IPTG）結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于別乳糖，是乳糖操縱子非常有效的誘導(dǎo)物?？烧T導(dǎo)lac操縱子表達(dá)，但不能被β-半乳糖苷酶水解。②異丙基硫代半乳糖苷IPTG異丙基硫代-β-D-半乳糖苷Isopropyl-beta-D-thiogalactoside異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalact34③

Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷③Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-ind35b-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)b-半乳糖苷酶b-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)36lacZ的a肽互補(bǔ)1）a-肽（lacZ’

）：b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸），該段基因序列連接到pUC載體上。受體菌基因組的b-半乳糖苷酶基因的缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成活性酶，不能分解XgallacZ的a肽互補(bǔ)1）a-肽（lacZ’）：b-半乳糖苷37pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼a肽與這個(gè)缺失突變的b-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，又能分解Xgal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受體菌lacZ載體lacZ’與a互補(bǔ)pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’編碼a肽與這個(gè)缺失突變的b-半38a互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ’的合成。不能互補(bǔ)。

lacZ’5’3’a肽移碼突變lacZ’5’3’a肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNAa互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位39通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MC40基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件41第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。T7啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子MCSlacZ’Amprori第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M142

將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。1）基因文庫(kù)的構(gòu)建（1）基因文庫(kù)（genelibrary）1.目的基因片段的獲得四.DNA的克隆過(guò)程將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片43（2）

基因組文庫(kù)的構(gòu)建1、提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，2、載體DNA的制備；3、DNA片段與載體連接與包裝

；4、重組噬菌體侵染受體菌；5、基因文庫(kù)的鑒定和擴(kuò)增（2）基因組文庫(kù)的構(gòu)建1、提取研究對(duì)象基因組DNA，制44基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件45

原位雜交，是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長(zhǎng)出可見(jiàn)的菌落，對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使DNA釋放出來(lái)，并使之固定在濾膜上并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。

原位雜交主要用來(lái)從用質(zhì)?；駽osmid構(gòu)建的基因文庫(kù)中尋找陽(yáng)性克隆，當(dāng)?shù)玫疥?yáng)性克隆后，再通過(guò)Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)這種方法在一張直徑為9cm的濾膜上，可檢測(cè)成幾百到一千甚至上萬(wàn)個(gè)菌落，達(dá)到高通量篩選的目的。（3）基因文庫(kù)的篩選原位雜交，是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾46原位雜交原位雜交47（1）cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱(chēng)cDNA。（2）cDNAlibrary2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱(chēng)cDNA文庫(kù)。（1）cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱(chēng)cDNA。48（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。（4）

構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提?。?）cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。（1）不含內(nèi)含子序列。（4）構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（149（2）mRNA的分離純化（2）mRNA的分離純化50（3）cDNA的合成用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成cDNA。（4）cDNA與載體連接在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。（3）cDNA的合成用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，51基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件52

適用于分離在特定組織中表達(dá)的基因、在細(xì)胞周期特定階段表達(dá)的基因、受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因、以及在特定發(fā)育階段表達(dá)的或是參與發(fā)育調(diào)節(jié)的基因，同時(shí)也可有效地用來(lái)分離經(jīng)特殊處理而被誘導(dǎo)表達(dá)地基因。

3）mRNA差別雜交或扣除雜交法分離目的基因適用于分離在特定組織中表達(dá)的基因、在細(xì)胞周期特定階段534）PCR擴(kuò)增獲得目的基因PCR(Polymerasechainreaction),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是DNA的體外酶促擴(kuò)增。是利用兩個(gè)短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過(guò)雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，使目的DNA片段在一定時(shí)間以指數(shù)方式增加百萬(wàn)倍。（1）PCR的概念4）PCR擴(kuò)增獲得目的基因PCR(Polymerasec54（2）［PCR原理］

類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA解離，使之成為單鏈；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；（2）［PCR原理］類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，PCR由55③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)鏈每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，重復(fù)循環(huán)：變性--退火--延伸三過(guò)程，就可2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸③引物的延伸：模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸56基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件57基因克隆簡(jiǎn)介ppt課件58（4）.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；cDNA擴(kuò)增；分析模板序列；（2）基因的體外誘變（4）.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因592.目的DNA片