分子遺傳學基礎-基因工程概述（普通遺傳學課件）

《遺傳學》PCR擴增技術內(nèi)容一二三四五聚合酶鏈式反應示意圖PCR反應的條件PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR引物PCR技術的應用在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K.B.Mullis發(fā)明的。

PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。聚合酶鏈式反應示意圖一、聚合酶鏈式反應示意圖PCR反應的溫度循環(huán)周期二、PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR反應的溫度循環(huán)周期二、PCR反應的溫度循環(huán)周期三、PCR反應的條件PCR反應的條件PCR引物：與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。其長度通常在15~30個核苷酸之間。簡并引物：簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。

四、PCR引物1、基因組克隆2、突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核酸序列。五、PCR技術的應用：在引物的5’端參入額外的DNA序列《遺傳學》Ti質(zhì)粒介導的整合轉(zhuǎn)化程序內(nèi)容一二三四Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能共整合轉(zhuǎn)化程序T-DNA染色體整合機制Ti質(zhì)粒的改造二元共整合轉(zhuǎn)化程序一、Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，其根部致瘤特性是由一種革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌細胞內(nèi)的野生型Ti質(zhì)粒介導所致的。Ti質(zhì)粒的圖譜整個質(zhì)粒160-240kb，其中T-DNA12-24kb。tms

的編碼產(chǎn)物負責：合成吲哚乙酸；tmr

的編碼產(chǎn)物負責：合成植物分裂素；tmt

的編碼產(chǎn)物負責：合成氨基酸衍生物冠癭堿。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制(一)、損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸。

二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（二）、它們能誘導Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（三）、vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復合物。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（四）、復合物轉(zhuǎn)化植物根部細胞二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制三、T-DNA的染色體整合機制四、Ti質(zhì)粒的改造（一）、除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因為大量的生長素和分裂素會抑止細胞再生長為整株植物；（二）、除去T-DNA上的有機堿生物合成基因（tmt）；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細胞的生長；（三）、除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；四、Ti質(zhì)粒的改造（四）、安裝大腸桿菌復制子，使其能在大腸桿菌中復制，以利于克隆操作；（五）、安裝植物細胞的篩選標記，如使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列；（六）、安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。五、共整合轉(zhuǎn)化程序六、二元整合轉(zhuǎn)化程序（一）、將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；（二）、重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細胞?！哆z傳學》基因工程的酶學基礎—限制性核酸內(nèi)切酶內(nèi)容一二三命名斷裂方式定義一、定義定義：這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的，一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是核酸內(nèi)切限制酶。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。R/M體系的作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。二、命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自微生物的屬名第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自微生物種名第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoRI來自于EscheriacoliRY13的第一個限制酶。三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（一）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。

Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（二）平末端

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。Sma15’CCCGGG3’

3’GGGCCC5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（三）同裂酶指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。（四）同尾酶指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。限制片斷的末端連接作用：分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子。分子內(nèi)連接分子間連接《遺傳學》基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟內(nèi)容一二基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟基因工程的支撐技術1、從復雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；切2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子；接一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（寄主細胞），并與之一起增殖；轉(zhuǎn)4、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了細胞重組DNA分子的受體細胞克隆；增一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：5、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用；檢6、將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟基因工程研究的基本技術路線基因工程流程圖1、核酸凝膠電泳技術；2、核酸分子雜交技術；3、細菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術；4、DNA序列分析技術；5、寡核苷酸合成技術；6、基因定點突變技術7、聚合酶鏈反應（PCR）技術。二、基因工程的支撐技術《遺傳學》基因工程發(fā)展史內(nèi)容一二三基因工程定義基因工程發(fā)展史一、基因工程定義也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。一般說來所謂的基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細胞中內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。多利和它的孩子二、基因工程發(fā)展史（1）在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎問題。（2）在50年代揭示了DNA分子的雙螺旋模型和半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞的問題。（3）在50年代末期和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功的破譯了遺傳密碼，從而闡明了信息的流向和表達問題。（一）基因工程的準備階段1、理論基礎中心法則每個基因都被認為是編碼著一種蛋白質(zhì)分子，所以人們一直十分重視研究單基因的結(jié)構(gòu)與功能的關系。怎樣重復雜的DNA中分離單基因，以便能在體外研究其結(jié)構(gòu)和功能的一系列問題，成為基因工程的關鍵所在。（1）20世紀60年代末70年代初，限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等的發(fā)現(xiàn)，使DNA分子進行體外切割和連接成為可能。（2）70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技術問世。這兩項技術，使DNA的結(jié)構(gòu)分析問題得到了根本的解決。2、技術基礎（3）1972年首次構(gòu)建了一個重組DNA分子，并提出了體外重組的DNA分子進入宿主細胞的過程，以及在其中進行復制和有效表達等問題。（4）在60年代還發(fā)展出了瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交技術，這對于DNA片斷的分離、檢測十分有用，并很快被應用于基因操作實驗。2、技術基礎二、基因工程發(fā)展史1973年Cohen等首次完成了重組質(zhì)粒DNA對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，同時與S.Boyer合作，將非洲爪蟾含核糖體基因的DNA片段與質(zhì)粒pSC101重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)錄出相應的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式問世；并說明了質(zhì)粒分子可以作為基因克隆的載體能攜帶外源基因?qū)胨拗骷毎?，也說明了真核生物的基因可以轉(zhuǎn)移到原核生物細胞中并在其中實現(xiàn)功能表達。（二）基因工程問世二、基因工程發(fā)展史自基因工程問世以的這二十幾年是基因工程迅速發(fā)展的階段。如果說20世紀八九十年代是基因工程基礎研究趨向成熟，那么二十一世紀將是基因工程應用研究的鼎盛時期。（三）基因工程的發(fā)展《遺傳學》分子輔助育種的常見分子標記內(nèi)容一二三分子標記育種的定義分子標記輔助育種需具備的基本條件常見分子標記分子標記輔助育種：利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標記，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目標性狀的目的，具有快速、準確、不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點。一、分子標記輔助育種定義由此可見，傳統(tǒng)育種法和標記輔助選擇法在本質(zhì)上沒有什么區(qū)別，但在選擇效率和準確性方面，后者比前者大大提高?；蜣D(zhuǎn)移基因型選擇基因轉(zhuǎn)移相關的品種、亞種、種表型選擇傳統(tǒng)育種法:標記輔助選擇:相關的品種、亞種、種相關的品種、亞種、種相關的品種、亞種、種三、分子標記輔助育種需具備的基本條件1、分子標記與目標基因共分離或緊密連鎖；2、分子標記檢測容易，重演性好；3、基本實驗手段及計算機統(tǒng)計分析軟件。RM49RM1861.8RM550.6RM1688.5MRG49243.3RM4161.7AC8878a1.7AC2823a0.3bel0.1AC2827a0.4RM38671.2MRG10041.60.0三、常見的分子標記（一）、RFLP標記1、定義：RFLP，即限制性片段長度多態(tài)性，是指用限制性內(nèi)切酶酶切不同個體的基因組DNA后，含有與探針序列同源的酶切等位片段在長度上的差異。2、應用：（1）植物遺傳連鎖圖的構(gòu)建；（2）分子標記輔助選擇；（3）遺傳關系分析及數(shù)量遺傳研究等。三、常見的分子標記3、該技術包括以下基本步驟：（1）DNA提??；（2）用DNA限制性內(nèi)切酶消化；（3）凝膠電泳分離限制性片段；（4）將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上；（5）用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標記的DNA作探針與膜上的（6）DNA雜交（稱Southern雜交）；（7）放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。三、常見的分子標記（二）、AFLP標記1、定義：即擴增片段長度多態(tài)性，是一種將RFLP與PCR相結(jié)合的分子標記。2、基本原理：其基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增，模板是連接雙鏈人工接頭的酶切片段，引物的結(jié)合部位是接頭以及與之相連的酶切片段中的幾個堿基序列。AFLP基本原理3、AFLP標記的特點：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術所產(chǎn)生的標記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結(jié)果可靠；（5）模板DNA用量少，而且對模板濃度的變化不敏感；（6）目前該技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。三、常見的分子標記（三）、SSR標記1、基本原理：SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復。不同遺傳材料重復次數(shù)的可變性，導致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產(chǎn)生的基礎。三、常見的分子標記盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標記。ATATATATATAT2ATATATATATATATATATATATATATATATAT13123PCR擴增微衛(wèi)星多態(tài)性分析示意圖三、常見的分子標記2、SSR標記的特點：（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此 其開發(fā)有一定困難，費用也較高。《遺傳學》基因工程在植物方面的應用內(nèi)容一二三四五提高植物的抗蟲性提高植物的抗病性提高植物的抗逆性改良植物的品質(zhì)思考問題轉(zhuǎn)基因工程技術主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力,以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。一、提高植物的抗蟲性二、提高植物的抗病性轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯三、提高植物的抗逆性四、改良植物的品質(zhì)四、改良植物的品質(zhì)四、改良植物的品質(zhì)不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆1、目前用于殺蟲的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物基因有哪些?2、抗病轉(zhuǎn)基因植物所采用的基因，使用最多的是什么?3、使煙草、番茄的耐寒能力提高措施是什么?4、

大米、玉米、小麥中哪種必需氨基酸較少?舉例說明科學家如何提高氨基酸的含量?五、思考問題？《遺傳學》應用分子標記構(gòu)建遺傳圖譜內(nèi)容一二遺傳作圖基本原理—連鎖分析構(gòu)建分子遺傳圖譜的基本程序孟德爾獨立分配規(guī)律的要點是：各種配子基因型的比率是相等的（如左圖）；若出現(xiàn)親本型配子的比率高于重組型配子，則說明基因間出現(xiàn)連鎖（如右圖）。一、遺傳作圖基本原理—連鎖分析二、構(gòu)建分子遺傳圖譜的基本程序1、親本確定；2、構(gòu)建遺傳作圖群體；3、篩選親本間具有多態(tài)性的標記；4、檢測群體中每個個體的標記型；5、分析數(shù)據(jù)，建立連鎖群；6、確定連鎖群所屬的染色體；7、分子標記與目標基因共分離或緊密連鎖。（一）、作圖親本的確定1、作圖親本的要求（1）親本間必須有較遠的親緣關系，以保證親本間有較高的遺傳差異（遺傳多態(tài)性）；但親本間親緣關系也不能太遠，否則會影響F1的育性，難以建立足夠大的群體，并且可能造成后代嚴重的偏分離現(xiàn)象，影響遺傳作圖的可靠性。（2）一般先挑選幾個候選品種，隨機選擇一些探針或引物，對它們標記分析，然后根據(jù)分析結(jié)果，選擇多態(tài)性較高的一對品種做為親本。2、作物上建立遺傳作圖的群體（1）暫時性分離群體。

BC1（回交一代）和F2是最常用的遺傳作圖群體，其優(yōu)點是容易建立，速度快。其中BC1由于直接反映了F1配子的分離比例，因而在連鎖統(tǒng)計分析上具有比F