第15講組織工程課件

第15講組織工程第15講組織工程1再生鳳凰(Chinesephoenix/phoenix)：雄的叫鳳，雌的則叫凰。象征祥瑞。神話中說，鳳凰每次死后，會周身燃起大火，然后其在烈火中獲得重生，并獲得較之以前更強大的生命力，稱之為“鳳凰涅磐”。再生鳳凰(Chinesephoenix/phoenix)2蚯蚓被截為兩截以后，斷面上肌肉組織快速溶解，然后形成新的細胞團。這時，血液中所含的白細胞也會同時集中在切面上，形成特殊的栓塞，從而使傷口快速閉合。中胚層細胞還具有十分強的分化能力，快速移動至傷口切面上來，在切面上形成一個個結節(jié)狀的凸起，就被稱為再生芽。同時，蚯蚓體內的消化道、血管，以及神經系統(tǒng)等組織的細胞，經過許多分裂，快速地向再生芽里不斷生長，切面上就會快速地再生出另外一個頭來，并且另一端也會自然生出一條尾巴來。蚯蚓被截為兩截以后，斷面上肌肉組織快速溶解，然后形成新的細胞3器官移植《圣經》中，上帝始造天地耗時七日，在第六日里用泥土按自己的形狀捏成個泥人，然后吹了一口仙氣于其中，亞當便有了生命。上帝造了亞當之后，讓他當世間萬物的主宰，還給他建了個園子，取名為伊甸園（Eden），其意為“樂事，愉快”。取其第七肋骨塑成女狀，再吹之以仙氣，遂成夏娃（意即“賦予生命”）。器官移植《圣經》中，上帝始造天地耗時七日，在第六日里用泥土按4荷馬《伊利亞特》中，描繪了一個叫做凱米拉（Chimera）的怪獸：獅頭、羊身、蛇尾，并且背部及尾部又分別伸出一羊頭和蛇頭。在現(xiàn)代移植學中，凱米拉一詞譯為嵌合體。丹麥童話美人魚美人魚（安徒生）荷馬《伊利亞特》中，描繪了一個叫做凱米拉（Chimera）的5龍龍是中國的象征、中華民族的象征、中國文化的象征。龍是中國古人對魚、鱷、蛇、豬、馬、牛等動物，和云、雷電、虹霓等自然天象模糊集合而產生的一種神物：馬頭（駝、牛、揚子鱷頭），象鼻，鯉魚須，蛇身，鹿角，龜眼（兔、虎），魚鱗，虎掌，鷹爪，牛耳，魚尾構成的。龍龍是中國的象征、中華民族的象征、中國文化的象征。6換心術傳說戰(zhàn)國時代的典籍《列子》記載：魯國的公扈和趙國的齊嬰得了痼疾去找神醫(yī)扁鵲醫(yī)治。扁鵲對公扈說：“汝志疆而氣弱，故足于謀而寡于斷。齊嬰志弱而氣疆，故少于虛而傷于專。故換汝之心，則均善矣?！北怡o先給他倆喝了一種自治的麻醉藥。然后為兩人做了開胸術，取出心臟互換。接著給他倆灌服了一種神奇的藥物，公扈和齊嬰隨即蘇醒過來，怪疾得以治愈。換心術傳說戰(zhàn)國時代的典籍《列子》記載：魯國的公扈和趙國的齊嬰7現(xiàn)代的器官移植1936年，一位年僅26歲的青年人，由于一位汞中毒導致腎衰竭，無藥可救。前蘇聯(lián)醫(yī)生沃羅諾夫將一個尸體的腎臟移植到病人體內，但沒有獲得成功，病人在48小時后死去了。1967年，南非醫(yī)生巴納德為一名商人成功地作了人類首例異體心臟移植手術。病人手術后順利地度過了17天，雖然由于肺炎最終奪取了他的第二次生命，但是，這在人類器官移植史上畢竟是一個里程碑式的偉大成就。現(xiàn)代的器官移植1936年，一位年僅26歲的青年人，由于一位汞8異體移植：較強免疫排斥反應，異體器官來源有限。組織代用品：人體相容性差，不能長久使用，還易引起感染。問題：能否用細胞培養(yǎng)再生組織器官達到替換的目的？/v_show/id_XNTQ1ODgyMDA=.html/gb/wbpaper/2007-12/18/content_1406413.htm異體移植：較強免疫排斥反應，異體器官來源有限。9本節(jié)主要內容：1.組織工程技術2.組織工程應用本節(jié)主要問題種子細胞、組織工程材料、細胞因子本節(jié)主要內容：10

第一部分組織工程技術第15講組織工程課件11一定義組織工程(TissueEngineering)：是利用生命科學、醫(yī)學、工程學原理與技術，單獨或組合地利用細胞、生物材料、細胞因子實現(xiàn)組織修復或再生的一門技術。20世紀80年代提出概念。JosephP.VacantiJohnHomansProfessorofSurgeryatHarvardMedicalschoolRobertLangerProfessorofChemicalandBiomedicalEngineeringatMIT一定義組織工程(TissueEngineering)：12二組織工程三要素1.種子細胞2.支架材料3.生長因子二組織工程三要素1.種子細胞13細胞外基質

(extracellularmatrixc,ECM)（1）定義：動物細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子。（2）分布：結締組織中ECM含量較高。（3）組成：構成細胞外基質的大分子包括：膠原、非膠原糖蛋白、彈性蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖四大類。（4）功能：1）ECMs提供細胞所需的力學和化學信息，是細胞發(fā)揮功能的環(huán)境；對細胞群體有支持、保護的作用。2）ECMs對細胞形態(tài)、遷移、增殖、分化有調節(jié)作用。細胞外基質

(extracellularmatrixc,E14以骨為例1-細胞成骨細胞：合成ECMs、礦物質、膠原，組裝成新骨破骨細胞：分泌酶使ECMs、礦物質、膠原被吸收軟骨細胞：合成ECMs,構成軟骨干細胞2-支架羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH，HA]、膠原纖維3-生長因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白以骨為例1-細胞15（一）種子細胞1.定義種子細胞(Seedcell)：是組織修復或再生的細胞材料。2.來源（1）功能細胞：組織來源的體細胞。（2）干細胞：胚胎干細胞、成體干細胞。3.特點容易獲得和體外培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定。4.問題（1）同種、異種細胞存在免疫排斥等問題。（2）干細胞潛在的理想種子細胞，誘導分化技術有待完善。（3）多種類型細胞協(xié)調增殖、分化。（一）種子細胞1.定義16（二）支架材料1.定義組織工程支架材料是指替代細胞外基質使用的生物醫(yī)學材料。（二）支架材料1.定義172.特點（1）生物相容性：生物醫(yī)學材料引起宿主反應和產生有效作用的能力。（2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被降解，降解速率與細胞生長速率相互協(xié)調。（3）合適的三維立體結構。（4）加工性與一定的機械強度。（5）良好的消毒性能。2.特點183.分類有機材料與無機材料；天然材料和人工合成材料；單一材料和復合材料。（1）有機材料1）天然高分子材料膠原、殼聚糖、透明質酸等。3.分類19A蛋白類膠原（Collagen）膠原是細胞外最重要的水不溶性纖維蛋白,是構成細胞外基質的骨架，是胞外基質重要的結構蛋白。根據(jù)組成的氨基酸與聚合度不同有10種。具有高度纏繞的螺旋結構的纖絲，由纖絲與其他基質分子相互作用達到組織需要的強度、彈性。成纖維細胞、成骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞等合成或分泌，分布于各個部位。A蛋白類膠原（Collagen）20B多糖類殼聚糖（Chitosan）甲殼質的基本單位是乙酰葡萄糖胺，它是由1000～3000個乙酰葡萄糖胺殘基通過β-1，4-糖苷鍵相互連接而成聚合物，是節(jié)肢動物角質內的主要結構多糖。殼聚糖是甲殼質的部分脫乙酰化產物，具有陽離子性質，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等帶負電荷的大分子聚集在支架內，即利于收集組織液中的生長因子。B多糖類殼聚糖（Chitosan）21透明質酸（Hyaluronicacid,HA）透明質酸是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重復結構組成的線形多糖結構。在結締組織中比較豐富。透明質酸可高度水化，對組織的水分平衡和關節(jié)的潤滑有重要作用，已經在整形外科中被廣泛采用。保護及潤滑細胞，在化妝品、美容行業(yè)廣泛使用。透明質酸（Hyaluronicacid,HA）222）合成高分子材料聚乳酸（Polylacticacid，PLA）聚羥基乙酸（Polyglycolicacid，PGA）聚羥基丁酸（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。2）合成高分子材料23（2）無機材料氧化鋁陶瓷、碳纖維、生物陶瓷、羥基磷灰石、合金等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工關節(jié)等。例如：鈷、鈦、鋼鐵基合金金屬材料組成人工髖關節(jié)的股骨頭、膝關節(jié)的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料組成人工髖關節(jié)的髖臼股、人工膝關節(jié)的脛骨平臺部分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工關節(jié)假體與骨組織的固定。（2）無機材料氧化鋁陶瓷、碳纖維、生物陶瓷、羥基磷灰石、合金24各種無機材料氧化鋁陶瓷碳纖維生物陶瓷羥基磷灰石各種無機材料氧化鋁陶瓷碳纖維生物陶瓷羥基磷灰石25（3）復合材料復合材料：由兩種或兩種以上不同物理化學性質的材料復合而成的新材料，一般由基體材料和增強材料組成。包括無機材料、有機材料、天然材料與合成材料間的組合。例如：羥基磷灰石-甲殼素、羥基磷灰石-PLA、聚乳酸（Polylacticacid,PLA）-聚羥基乙酸（Polyglycolicacid,PGA）：PLGA等。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（3）復合材料復合材料：由兩種或兩種以上不同物理化學性質的材26（三）生長因子細胞對外部環(huán)境產生的應答是通過感知某種化學信號或物理刺激，并將之傳遞到細胞核中，促發(fā)或者抑制基因的表達實現(xiàn)的。細胞的增殖與分化由各種因子調節(jié)。（三）生長因子細胞對外部環(huán)境產生的應答是通過感知某種化學信號271.物理因子主要是應力的作用：流體切應力（Flowshearstress）：由血流對血管壁施加的力。體外可采用常流和脈動流循環(huán)裝置調節(jié)切應力大小。張應力（Tensilestress）：體內有心臟搏動，肌肉收縮等張應力?？刹捎脧椥耘菽蚣徔椌W等載體材料模擬體內的張應力。1.物理因子主要是應力的作用：28細胞生長因子細胞生長因子（Cellgrowthfactor）主要是指在細胞間傳遞信息、對細胞生長具有調節(jié)功能的一些多肽。轉移生長因子-β（Transforminggrowthfactor-β,TGF-β）：一種分泌型的多功能蛋白，可以調節(jié)細胞增殖、分化與細胞外基質分泌，參與炎癥和組織的修復。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)：1965年于脫礦化骨的骨基質中發(fā)現(xiàn)的，因其能誘導骨、軟骨形成而得名。細胞生長因子細胞生長因子（Cellgrowthfacto29成纖維細胞生長因子（Fibroblastgrowthfactor,FGF）：是不含糖的分子量為16KD的單鏈多肽，因能促進成纖維細胞生長而得名。由于對血管也有較強的促進作用，又稱為血管生長因子?？梢哉T導血管化、骨形成并促進神經再生。表皮生長因子（Epidermalgrowthfactor,EGF）：是由53個氨基酸組成的單鏈多肽。是表皮細胞和間充質細胞的一種有效的促分裂劑。能促進傷口愈合，在體外可以刺激角化細胞分裂，在體內促進上皮的再生。成纖維細胞生長因子（Fibroblastgrowthfa30神經生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)為神經細胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白，是具有營養(yǎng)、保護神經元及促進突起生長等生物學功能的神經細胞調節(jié)因子。對中樞及周圍神經元的發(fā)育、分化、生長、修復、再生和功能特性均有重要的調控作用。肝細胞生長因子（Hepatocytegrowthfactor，HGF）因最初被發(fā)現(xiàn)可剌激肝細胞合成DNA而得名，是由728個氨基酸殘基組成的多肽單鏈。肝細胞生長因子是目前已知生物活性最廣泛的生長因子之一，能刺激多種上皮和內皮細胞進行有絲分裂、運動，能促進腎小管形態(tài)發(fā)生，在腎臟的發(fā)育、再生中具有較強的作用。神經生長因子(Nervegrowthfactor,NG31生長因子研究與制備

—骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）1965年美國首先從骨基質中分離出骨形態(tài)發(fā)生蛋白，經過25年才得以純化。隨后克隆了相關基因。原位狀態(tài)下以ng/g骨基質劑量釋放足以促發(fā)骨修復，人工基質需要mg/g劑量才能促發(fā)骨修復，因此成本非常高。利用轉基因技術將BMP基因轉染到骨髓細胞中，再將其種植在礦化基質上，達到骨修復的目的。生長因子研究與制備

—骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）1965年美32三技術路線與方法三技術路線與方法33（一）細胞接種浸漬法：將經預濕處理材料置于細胞懸浮液中實現(xiàn)細胞接種。沉淀法：將細胞液緩慢逐滴滴加到已經預濕的支架材料上，放置培養(yǎng)箱中2-4小時，待細胞充分粘附后緩慢加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。凝膠法：將高密度細胞懸浮液與多種物質如膠原、藻酸納、幾丁質等按照一定工藝復合形成凝膠，細胞均勻地分布于凝膠內。吸附法：將已預濕的支架材料置于培養(yǎng)皿中的細胞懸液中或用滴管將細胞液滴加在材料上，然后利用負壓使細胞吸附在材料上。（一）細胞接種浸漬法：將經預濕處理材料置于細胞懸浮液中實現(xiàn)細34（二）細胞因子的控制釋放1.在支架材料構建時使細胞因子結合在支架材料內部，并能緩慢釋放。2.包埋或者微囊化是目前控制細胞生長因子釋放的一個重要方法（二）細胞因子的控制釋放1.在支架材料構建時使細胞因子結合在35（三）組織工程生物反應器1.微重力旋轉式生物反應器（1）轉壁式生物反應器：一般由兩個內外同心圓柱組成。內柱由半透膜構成，氣體可通過膜交換。內外柱之間充以連續(xù)灌注的培養(yǎng)介質。將細胞與培養(yǎng)液置入內、外圓柱體。整個裝置可以繞內軸旋轉，離心力與重力平衡，為細胞生長提供一個微重力環(huán)境。普通培養(yǎng)條件下只能呈二維貼壁生長的哺乳動物細胞表現(xiàn)出三維增殖與分化形成有功能的組織塊。（三）組織工程生物反應器1.微重力旋轉式生物反應器36（2）流體應力生物反應器模擬人體血管應力環(huán)境而設計的用于體外構建組織工程化血管的裝置。主要由可以通過循環(huán)液體的硅膠管、壓力傳感器、蠕動泵、儲液罐、電磁閥等組成。可通過形成有波動的液流并能控制流量來模擬體內血管的應力環(huán)境。（2）流體應力生物反應器37第二部分組織工程應用第15講組織工程課件38一組織工程皮膚中國每年燒傷、潰瘍等皮膚疾病1500萬人，需要皮膚移植的約350萬，需4億立方厘米。一組織工程皮膚中國每年燒傷、潰瘍等皮膚疾病1500萬人，39人工表皮、復合人工皮A表皮B表皮網狀棘C真皮乳頭D真皮E皮下組織F毛發(fā)人工表皮、復合人工皮A表皮40組織工程皮膚技術路線組織工程皮膚技術路線41構建步驟（1）種子細胞與培養(yǎng)液成纖維細胞：DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素等。表皮角質形成細胞：DMEM+HamF-12培養(yǎng)基、表皮生長因子等。（2）支架材料聚羥基乙酸（PGA）。構建步驟（1）種子細胞與培養(yǎng)液42（3）構建成纖維細胞-PGA復合物酶法消化收集真皮成纖維細胞，接種在PGA上，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。（4）接種表皮角質形成細胞在前面的復合物上，更換表皮角質形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)5天左右。（3）構建成纖維細胞-PGA復合物43（5）雙層皮膚成熟將復合物放在可滲透膜上，進行氣-液界面培養(yǎng)，促進表皮角質形成細胞的進一步分化。再培養(yǎng)1周，形成含真皮和表皮兩層結構的組織工程化皮膚。（5）雙層皮膚成熟將復合物放在可滲透膜上，進行氣-液界面培養(yǎng)44難題：1.血管化：血管生成是指內皮細胞構筑的毛細血管分支和伸展。血管生成有助于損傷組織的修復。2.毛囊、汗腺等再生。所以美容慎用。3.排異性。我國人造皮膚2007年第四軍醫(yī)大學開發(fā)成功，進入臨床階段。難題：45二神經修復工程神經遠端軸突和髓鞘崩潰時，大量吞噬細胞侵入，一方面清除軸突髓鞘的碎屑，另一方面刺激原來處于休眠狀態(tài)的雪旺細胞(Schwanncell．SC)分裂和增生，并沿著每一根神經纖維的神經內膜和基底膜排列成柱狀，形成一個潛在的管道（即Buengner氏細胞帶）；再生軸突通過Buengner氏細胞帶，伸延到終末器官，恢復其功能。最后產生髓鞘，形成為有髓神經纖維。（一）種子細胞雪旺細胞(Schwanncell．SC)：SC形成能引導再生軸突生長的Buengner氏細胞帶，并能分泌多種細胞因子調控再生軸突生長。二神經修復工程神經遠端軸突和髓鞘崩潰時，大量吞噬細胞侵入，46（二）支架材料目前比較常用的生物材料是聚羥基乙酸(polyglyeolicacid．PGA)和聚乳酸(polylacticacid．PLA)。制成直線的絲狀有利于SC排列成線狀，為形成Buengner氏細胞帶制造有利條件。此外材料要及時降解，讓位給成長的有髓神經。（二）支架材料目前比較常用的生物材料是聚羥基乙酸(poly