羥苯磺酸鈣對糖尿病大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

羥苯磺酸鈣對糖尿病大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

世界糖尿病患者的人口逐年增加，近年來呈顯著下降趨勢。國際糖尿病協(xié)會（idf）預計，到2035年，糖尿病患者將達到5.92億。1材料和方法1.1分子量80gm/片格列齊特:分子式C15H21N3O3S,分子量323.4,80mg/片(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,批號:A1602001);羥苯磺酸鈣:分子式C1.2青龍山動物繁殖場8周齡雄性SD大鼠55只體重(200±20)g,購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場[動物許可證號:SCXK(浙)2014-0001]。試驗期間,大鼠飼養(yǎng)于溫度22～25℃,相對濕度60%～70%的環(huán)境下,自然光照,定時進食和飲水。1.3g/lg/h普通飼料適應期喂養(yǎng)1w,隨機抽取9只大鼠作為正常對照組(A組,生理鹽水,5mL/kg·d,n=9),剩下的大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4w腹腔注射STZ45mg/kg。72h之后大鼠尾靜脈取血,測量造模大鼠空腹血糖≥16.7mmol/L視為造模成功,將造模成功的37只大鼠隨機分為4組:糖尿病模型組(B組,生理鹽水,5mL/kg·d,n=9)、格列齊特組(C組,25mg/kg·d,n=9)、羥苯磺酸鈣組(D組,150mg/kg·d,n=10)、格列齊特聯(lián)合羥苯磺酸鈣組(E組,12.5mg/kg·d+75mg/kg·d,n=9),按照上述劑量每天8點至10點大鼠灌胃給藥,正常對照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。1.4精神狀態(tài)的變化觀察大鼠的飲食情況,體重,毛發(fā),精神狀態(tài)。在給藥之前以及給藥之后第2周、4周、6周、8周測各組大鼠的體重,給藥之前和給藥之后測各組大鼠的空腹血糖。1.5最大質(zhì)量分數(shù)灌胃給藥8w之后各組大鼠禁食12h,腹腔注射麻醉劑25%的烏拉坦(4mL/kg)。取大鼠右眼,使用生理鹽水反復沖洗,去除眼前節(jié),玻璃體,將含有視網(wǎng)膜組織的眼杯放置在4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋,切片并進行常規(guī)HE染色,采用中性樹膠封片,在400倍光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學的變化。1.6現(xiàn)雙抗加藥試驗低溫提取組織蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔上樣60μg蛋白,10%SDS分離樣品之后轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉,分別滴加β-actin(1:400)、一抗PKC(1:200)、VEGF(1:1000)、HIF-1α(1:500)4℃過夜,洗膜,二抗(1:2000)室溫孵育2h。洗膜后將ECL化學發(fā)光劑滴到PVDF膜的正面,采用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,選取合適的條帶用AIC(AIphaView)軟件進行蛋白條帶分析。1.7統(tǒng)計方法采用DAS3.0軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析,用“均數(shù)±標準差”表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析,以2結(jié)果2.1處理量、體重正常對照組大鼠生活狀態(tài)活躍,毛發(fā)干凈整齊有光澤,大便為顆粒狀,尿液為淡黃色,體重逐漸增加。糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳,萎靡不振、多食、多飲、體型瘦小、毛發(fā)疏松無光澤、掉毛嚴重,反應比較遲鈍、容易發(fā)怒。各用藥組相比較糖尿病模型組,上述情況均有不同程度的改善。2.2各組大鼠體重的變化與正常組相比,糖尿病模型組大鼠的體重顯著下降(2.3各組大鼠的空腹血糖與正常組相比,糖尿病模型組大鼠的空腹血糖含量明顯升高(2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的比較顯微鏡下觀察,空白對照組大鼠視網(wǎng)膜組織的各個結(jié)構(gòu)層次清晰分明,組織結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,細胞形態(tài)完好,細胞有序排列。與空白組比較,模型組視網(wǎng)膜組織細胞排列紊亂沒有規(guī)則,有明顯水腫,各層結(jié)構(gòu)有疏松的情況;與模型組相比,各用藥上述情況都有不同程度的改善;與單用藥組相比,聯(lián)用組視網(wǎng)膜組織病理改善最為明顯(圖1)。2.5視覺組織中的pgc、vegf和hif-a的表現(xiàn)與正常組相比,糖尿病模型組PKC(3糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷的發(fā)生情況糖尿病是胰島素分泌絕對或者相對不足產(chǎn)生血糖、血脂代謝紊亂為特征的慢性疾病,會引起血液循環(huán)障礙,導致視網(wǎng)膜組織缺血和缺氧、組織水腫,廣泛的新生血管生成,最終引發(fā)視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生和發(fā)展的關鍵的因素是高血糖本試驗目的是考察格列齊特聯(lián)用羥苯磺酸鈣對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果,故試驗設計中各單用藥組以相關文獻中的劑量作為本試驗劑量,聯(lián)合用藥組兩種藥物劑量分別減半以考察聯(lián)合用藥的效果。實驗結(jié)果顯示,通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn),糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)出現(xiàn)改變,細胞排列紊亂沒有規(guī)則,水腫明顯,各層結(jié)構(gòu)有疏松的情況且細胞數(shù)量減少,說明長期的高血糖可引起大鼠視網(wǎng)膜產(chǎn)生病理性損傷。當各用藥組連續(xù)治療8w后,視網(wǎng)膜組織細胞排列紊亂的程度減弱,細胞數(shù)量部分恢復,損傷程度得到明顯改善,表明各治療組具有緩解糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷的作用,聯(lián)合用藥組對糖尿病視網(wǎng)膜病變的改善作用更加明顯。格列齊特對糖尿病大鼠的血糖體重影響較大,羥苯磺酸鈣是微血管保護劑,對血糖和體重影響較小。糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中相關蛋白PKC、HIF-lα和VEGF出現(xiàn)明顯的增加,格列齊特組和羥苯磺酸鈣組治療之后,PKC、HIF-lα和VEGF的表達均有不同程度的降低,說明格列齊特對糖尿病視網(wǎng)膜病變有影響。與單用藥組相比,聯(lián)用組VEGF蛋白表達的下調(diào)最為顯著,預示聯(lián)合用藥在視網(wǎng)膜病變中的作用更為重要。綜上所述,各用藥組均可下調(diào)糖尿病大鼠PKC、HIF-lα